硫化氢对鱼藤酮诱导的小胶质细胞活化和致炎因子生成的调节及机制研究

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1、硕士学位论文论文题目硫化氢对鱼藤酮诱导的小胶质细胞活化和致炎因子生成的调节及机制研究研究生姓名洪雨指导教师姓名刘春风胡丽芳专业名称神经病学研究方向神经变性疾病论文提交日期2013年4月硫化氢对鱼藤酮诱导的小胶质细胞活化及致炎因子生成的调节及机制研究中文摘要硫化氢对鱼藤酮诱导的小胶质细胞活化及致炎因子生成的调节及机制研究中文摘要目的：研究硫化氢（Hydrogensulfide,H2S）对鱼藤酮诱导的BV2小胶质细胞活化及炎症因子生成的调节作用，并探讨其相关机制。方法：以BV2细胞和原代培养的皮层小胶质细胞为研究对象，采用鱼藤酮建立细胞炎症模型。采用免疫荧光方法检测小胶质细胞

2、活化的特异性标记物Iba-1的表达；实时荧光定量PCR（QuantitativePolymeraseChainReaction,Q-PCR）检测小胶质细胞表面标记物CD68及YM1/2的表达；MTT比色法检测细胞活力；采用逆转录PCR（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction,RT-PCR）方法检测炎症相关蛋白环氧化酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）、白细胞介素（Interleukin,IL）-1βmRNA水平的变化；用活性氧族物质(Reactiveoxygenspecies,ROS)探针-双氢乙酰乙酸-

3、二氯荧光黄（Dichlorofluorescindiacetate,DCFH-DA）测定细胞内ROS含量；采用Westernblot测定p38的磷酸化及COX-2表达水平的变化；ELISA检测炎症相关因子前列腺素E2（prostaglandinE2,PGE2）的生成和释放；采用RT-PCR及Westernblot法检测胱硫醚-β--合成酶（cystathionine-β-synthase,CBS）的表达变化；采用亚甲蓝法检测细胞外HS浓度变化；采用瞬时转染技术构建过表达CBS的细胞模型；流式细胞术检测MES23.5多巴胺能神经元细胞的死亡。结果：免疫荧光方法及Q-PCR结

4、果显示，与对照组相比，鱼藤酮组BV2细胞Iba-1和CD68mRNA水平显著升高，相反地，YM1/2的mRNA下降，提示鱼藤酮能够有效I中文摘要硫化氢对鱼藤酮诱导的小胶质细胞活化及致炎因子生成的调节及机制研究激活小胶质细胞，成功诱导并建立炎症模型。与鱼藤酮组相比，NaHS预处理组的Iba-1和CD68mRNA水平显著降低而YM1/2mRNA明显升高；MTT比色法显示各组间细胞存活率无明显差别。RT-PCR结果显示，鱼藤酮能促使炎症相关因子COX-2及IL-1βmRNA水平显著升高（P<0.01），而NaHS能够抑制其增加（P<0.05）；DCF法显示鱼藤酮组细胞内ROS含

5、量升高（P<0.05），而NaHS及SB203580都能够抑制其升高（P<0.05）；Westernblot法结果显示，鱼藤酮能够促进p38的磷酸化（P<0.01），而NaHS能够抑制其磷酸化（P<0.05）；ELISA结果显示，鱼藤酮诱导的小胶质细胞中PGE2的生成和释放增多（P<0.05），而NaHS能够抑制其增加（P<0.05）。RT-PCR和Westernblot结果一致显示，与对照组相比，鱼藤酮诱导的BV2细胞中CBSmRNA-和蛋白表达均显著降低；亚甲蓝法显示细胞外HS浓度也下降，提示细胞内硫化氢生成降低。利用瞬时转染技术构建过表达CBS的细胞模型，结合Wes

6、ternblot，结果发现与转染载体组相比，CBS过表达组鱼藤酮诱导的p38磷酸化明显下调（P<0.05），细胞外PGE2水平与p38的变化趋势相一致（P<0.001）；流式细胞检测结果显示，鱼藤酮处理的BV2细胞条件培养基能诱导MES23.5多巴胺能细胞的凋亡（P<0.01），而NaHS与处理的条件培养基能够减少其凋亡（P<0.05）。结论：内、外源性H2S均能够抑制鱼藤酮诱导的小胶质细胞激活及炎症相关因子的释放，该作用可能与抑制p38MAPK通路的活化有关，而且H2S发挥抗炎症作用同时，对多巴胺细胞也能起到间接的保护作用。这些结果表明，H2S参与了对鱼藤酮诱导的小胶质

7、细胞激活所致的炎症反应的调节。关键词：硫化氢；鱼藤酮；小胶质细胞；神经炎症作者：洪雨指导教师：刘春风胡丽芳IIRegulationandmechanismofhydrogensulfideonrotenone-inducedmicrogliaactivationandproinflammatorycytokineproduction英文摘要Regulationandmechanismofhydrogensulfideonrotenone-inducedmicrogliaactivationandproinflammatoryc