甘蔗乙烯受体基因soers1表达、转化及启动子序列的研究

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1、分类号UDC$566．1633．6学学校代码10593学号1031301012密级——彦澎犬肇，，'。’_I位论文甘蔗乙烯受体基因SoERSl表达、转化及启动子序列的研究黄静丽专业名称作物栽培学与耕作学学院名称农学院指导教师王爱勤(教授)申请学位级别硕士论文提交日期2013年5月论文答辩日期2013．05．21学位授予日期2013年6月答辩委员会主席杨丽涛教授论文评阅人盲审评阅论文评阅人盲审评阅{郴删喇硎伽伽洲砌础洲Y2407829广西大学学位论文原创性和使用授权声盯一一本人声明所呈交的论文，是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除已特别加

2、以标注和致谢的地方外，论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得广西大学或其它单位的学位而使用过的材料。与我一同工作的同事对本论文的研究工作所做的贡献均已在论文中作了明确说明。本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属广西大学。本人授权广西大学拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权保存并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。本学位论文属于：口保密，在年解

3、密后适用授权。／叻i保密。(请在以上相应方框内打“√”)论文作者签名：真暂厕指导教师签名：气∥争聊作者联系电话：f∽缸77g√巧刎红p、l府7一”叫"mf．7L⋯哆厶可玛夕．：洲乙箱：：断期期子日日电广西大掌硕士掌位论文甘蔗乙烯受体基因&劂-表这、转化及启动子序列的研究甘蔗乙烯受体基因SoERSl表达、转化及启动子序列的研究摘要甘蔗为重要的糖料作物和经济作物，通过培育新品种，结合栽培技术来提高甘蔗糖分、产量、抗逆性，是甘蔗糖业的主要发展方向。乙烯在植物生长发育过程中具有重要调节作用，对乙烯信号转导途径及其相关基因已有不少研究，获得了多个受体基因，但对受

4、体基因调控机理尚未清楚。乙烯利能够显著提高甘蔗的产量、蔗糖分、抗逆性，但其作用分子机理也未明确。因此，本实验以新台糖22号为材料，进行了甘蔗乙烯受体基因SoE愁I表达、遗传转化和启动子序列研究。主要结果如下：1．SoERM表达分析。在伸长期和工艺成熟期，叶片中SoER印基因的表达为成熟叶>幼叶>老叶。在蔗茎中，老茎的表达量大于幼茎和成熟茎，伸长期成熟茎大于幼茎，而工艺成熟期成熟茎低于幼茎。在生理成熟期甘蔗不同组织部均能检测到SoERM基因的表达，说明该基因可能为组成型表达模式。干旱胁迫和黑暗条件下可以抑制成熟砷中SoERSl基因的表达；100rng儿乙

5、烯利处理伸长期甘蔗，成熟叶中SoE船I在第ld基因表达量急剧升高。在苗期进行6℃低温胁迫，叶中SoER肼的表达先降后升，低温胁迫后恢复生长2d，基因的表达回升。2．植物表达载体构建。根据本课题组前期从新台糖20号(ROC20)中克隆出甘蔗乙烯受体基因(GQ369007)序列，在其编码区设计特异引物，并从新台糖22号(ROC22)中克隆到ERS基因完整编码框序列，基因命名SoERSl。在上、下游引物分别加砌I和SmaI酶切位点，构建SoERSl正义表达载体pBIERS。利用软件SiRNATa唱etFinder预测和分析SoERM基因siRNA干扰片段，最

6、终选定编码区前403bp，将该片段分别正向、反向插入中间载体176中，再用EcoRI、Hin饥II双酶切中间载体176，将目的片段切下连接到表达载体pCAMB认1300上，把目的基因连接到pCAMBIAl300，构建了RNAi干扰载体p1300ERS。3．SoERM遗传转化和原核表达。通过农杆菌介导法，把pBIERS转入烟草k346，PCR检测目的片段与载体GFP基因序列，确认甘蔗SoERM基因已经整合到烟草基因组DNA中，转化效率为61％。对苗期转基因烟草喷施200m∥L的乙烯利可以提高烟草叶片的乙烯释放速率。广西大掌硕士掌位论文甘蔗乙烯受体基因So

7、ERSl表达、转化及启动子序列的研究构建的非融合原核表达载体pETERSl和融合原核表达载体pETERS2在原核菌株BL21(DE3)和Rosetta(DE3)均不能表达，这可能与该基因序列中稀有密码子含量较高，或酶蛋白自身某些特性不适合在原核细胞里表达有关。4．SoERSl启动子序列克隆和分析。采用基于热不对称交错式PCR原理的染色体步移技术，克隆甘蔗SoERSl基因上游启动子序列，得到位于翻译起始密码予ATG之前的序列1410bp，在GeneBank登录号为KC862312。该序列与玉米ERS25和玉米ERSl4核苷酸同源性分别为82％和80％。利

8、用PlantCARE和PLACE在线预测该启动子序列，发现该序列除了含有启动子基本作用元件CA