芍药泛素和乙烯受体基因的克隆、分析及pletr1烟草转化

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1、分类号UDC密级编号硕士学位论文芍药泛素和乙烯受体基因的克隆、分析及PlETR1烟草转化CloningandAnalysisofUbiquitinsandEthyleneReceptorsofPaeoniaLactifloraandTobaccoTransformationofPlETR1学位申请人：徐杰指导教师：范丙友教授、胥华伟副教授一级学科：生物学二级学科：细胞生物学学位类别：理学硕士2016年05月万方数据独创性声明本人声明，所呈交的论文是我个人在导师指导下完成的研究工作及取得的研究成果。据我所知，文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其

2、他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河南科技大学或其它教育机构的其他学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：日期：关于论文使用授权的说明本人完全了解河南科技大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校拥有对所有学位论文的复制权、传播权、汇编权及其它使用权（特殊情况需要保密的论文应提前说明，但在解密后应遵守此规定）。需要保密的论文请填写：本学位论文在年月至年月期间需要保密，解密后适用本授权书。（需要保密的学位论文无须向图书馆提供论文的电子文档）研究生签名：导师签名：日

3、期：万方数据摘要摘要芍药（PaeonialactifloraPall.）为芍药科芍药属花卉，是我国传统名花。但是，芍药与其它鲜切花一样，会随着花朵的开放迅速衰老。乙烯，作为一种植物激素，在植物生长和发育过程中起着重要作用，并调控花衰老。花朵乙烯水平的增加与花衰老相关。本研究克隆了芍药品种‘桃花飞雪’的乙烯受体基因家族成员、分析其表达水平并进行了PlETR1基因的烟草遗传转化。另外，本研究开发了一种新的PCR技术：引物池-随机引物对PCR，使用该技术克隆到7个芍药泛素基因。研究结果如下：（1）通过RT-PCR获得芍药3条乙烯受体基因相关序列，结合本实验

4、室在前期工作中借助RACEPCR技术获得的1条乙烯受体基因相关序列，生物信息学分析发现这4条非冗余序列编码的多肽链分别为拟南芥AtETR1、AtETR2、AtERS1和AtEIN4的同源序列，因而将这4个推测的基因命名为PlETR1、PlETR2、PlERS1和PlEIN4。克隆获得的芍药PlETR1、PlETR2、PlERS1和PlEIN4DNA片段长度分别为2817bp、2286bp、2016bp和2295bp，依次编码740、761、633和764个氨基酸，核酸序列GenBank登录号为JX406435、KP265306、KP265307和KP

5、265308。生物信息学分析表明PlETR1、PlETR2和PlERS1的N端3次跨膜，PlEIN4的N端4次跨膜。结构域分析显示这4个乙烯受体均具有GAF、HisKA和HATPase_c3个典型的乙烯受体结构域，PlETR1、PlETR2和PlEIN4具有REC结构域，而PlERS1无此结构域。以芍药花瓣不同发育时期表达最稳定的Actin2作为内参基因，采用实时荧光定量PCR技术分析这4个受体在芍药开花指数1～6级时的花瓣中的表达水平，结果表明：芍药乙烯受体的不同家族成员的表达模式和表达水平不同，PlETR1在1～5级花瓣中的表达模式呈“V”形，6

6、级时仍然维持在较高水平；PlETR2在花瓣发育的6个阶段表达量都很低；PlERS1和PlEIN4在芍药花发育的6个阶段表达模式相似，在2级时的最低，6级时的最高，变化趋势都是从1级时的较高水平先下降后上升，再下降，随之上升到6级时的最高水平，整体的变化趋势近似“W”形。不同乙烯受体的差异表达模式表明芍药花瓣对乙烯具有复杂的响应机制。（2）以cDNA为模板，扩增PlETR1序列，将其连接到过表达载体pCambia1301-UbiN上并将重组载体导入农杆菌，采用叶盘法转化烟草。遗传转化的标记基因能够代谢潮霉素B，因而转基因成功的植株具有潮霉素B抗性。农杆

7、菌侵染的烟草叶片接种到潮霉素选择培养基上，将烟草叶片愈伤组织分化形I万方数据摘要成的幼苗种在蛭石-草炭土基质中，幼苗长大后在DNA和RNA水平检测目的基因。本研究通过PCR确定PlETR1已经整合到烟草的基因组DNA上，并且借助RT-PCR确定PlETR1在烟草叶片中转录出RNA。（3）IlluminaHiSeq™2000测序平台获得的Reads（直接测序获得的序列）较短，很难对高同源性多基因家族（如泛素基因家族）成员进行正确拼接。为了获得正确且完整的编码区序列（Codingsequence，CDS），可从转录组数据中分离含有5'和3'非编码区（Un

8、translatedregion，UTR）的同一基因家族成员相关序列，在UTR区分别设计上下游引物F（For