斑马鱼内毒素炎症模型建立及中药抗内毒素炎症活性筛选研究

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1、南方医科大学2010级硕士学位论文斑马鱼内毒素炎症模型建立及中药抗内毒素炎症活性筛选研究Themodelingofzebrafishendotoxicinflammationanduseofitasascreeningmethodtoassessanti—endotoxicpropertiesoftheactivecomponentofTraditionalChineseMedicineactiveionlneseel课题来源：国家自然科学基金资助项目(No．81072747)广州市科技计划(No．12C

2、32121610)学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院杨丽玲余林中教授中药学学术型硕士研究生中医药学院2013年6月5日广州硕士学位论文斑马鱼内毒素炎症模型建立及中药抗内毒素炎症活性筛选研究硕士研究生：杨丽玲指导教师：余林中摘要研究背景内毒素(LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁的组成成分，可直接或间接引起机体发热、代谢改变、免疫功能紊乱，多器官功能损害、休克乃至死亡等许多病理生理过程。目前针对由内毒素触发的全身炎症反应综合征或脓毒症的治疗尚无特殊有效的措施，仍以糖皮质激素加对症治疗为主，寻找拮抗内

3、毒素的措施一直是基础医学与临床医学努力的方向。近十几年来，从中药及天然产物中寻找抗内毒素方法亦为关注的热点，一些中药、复方或其所含成分被证明对受内毒素攻击的动物有保护作用。凉膈散(载宋《和剂局方》)作为温病治疗常用名方，主要用于治疗感染、炎症等。方中重用连翘，清热解毒，以清除上焦无形之邪热，功专量重，是为君药。配黄芩以清胸膈郁热；大黄泻火通便，以荡有形之热于中，共为臣药。现代药理研究亦证实组成该方的主要单味药连翘、大黄、黄芩等都有不同程度的抗内毒素作用。目前，对急症医学、抗炎免疫药物研发显得尤为重要的是寻

4、找合适的动物模型进行抗内毒素药物筛选。而斑马鱼对此具有丰富的前景：体小，产卵量高，繁殖周期短，成本低；体外受精，发育全程透明，可实时观察病原体和损伤。此外，斑马鱼属于脊椎动物，其免疫系统与人类极为相似。斑马鱼作为理想的抗内毒素炎症药物筛选模型主要在于拥有先进的基因技术和大量的转基因系。比如，利用Tg(mpo：GFP)系可实时活体观测幼鱼中性粒细胞的生物学行为。这是中文摘要其它脊椎动物所无法实现的。本文为国家自然科学基金“凉膈散对内毒素急性肺损伤肺组织水液转运的影响及机制研究”和广州市科技计划项目“凉膈解毒

5、胶囊临床前药理及抗内毒素药效评价关键技术研究”的部分研究工作。在前述相关研究基础上，发挥斑马鱼在抗炎免疫药理研究及药物筛选方面的特色与优势，建立方便、快捷的中药抗内毒素活性筛选体系，并利用该体系对凉膈散方中部分成分的抗内毒素活性进行筛选，从转基因系、细胞化学水平、基因水平揭示该方抗内毒素作用的物质基础。研究目的与意义目的：建立斑马鱼内毒素炎症模型，探讨中药抗内毒素炎症活性筛选新方法，并在此基础上研究凉膈散方中活性成分连翘酯苷A、连翘苷、大黄素、黄芩苷对斑马鱼内毒素炎症模型的保护作用。意义：构建斑马鱼内毒素

6、炎症模型，为研究人类炎症免疫疾病相关的病理生理机制及在活体内进行快速药物筛选提供新的技术平台；利用马鱼内毒素炎症模型，建立一个介于体外初筛与哺乳动物验证之间的快速、低成本的中药抗内毒素活性筛选新方法，具有良好应用前景。研究方法1．脂多糖(LPS)诱导斑马鱼炎症模型的构建1．1．LPS染毒方式选择不同方式(浸泡、显微注射)同样给予相同浓度LPS，观察炎症表型变化：经中性红染色、苏丹黑B染色观察巨噬细胞、中性粒炎症迁移聚集情况；使用中性粒细胞转基因斑马鱼(mpo：GFP)，结合活体成像系统实时监测中性粒细胞炎

7、症迁移过程；观察荧光下炎症表型变化，统计存活情况，比较死亡率和生存时间(Kaplan-Meier曲线法)。1．2．LPS染毒时间(鱼龄)选择将不同发育时期的幼鱼(3天、5天、6天)显Ⅱ硕士学位论文微注射相同浓度LPS，统计存活情况，比较死亡率和生存时间(Kaplan-Meier曲线法)。1．3．LPS染毒剂量选择将不同浓度的LPS(0．5，0．4，O．25mg／m1)显微注射到一定时期的幼鱼中，统计存活情况，比较死亡率和生存时间(Kaplan-Meier曲线法)。在此基础上进行半数致死浓度LD50的测定。

8、2．基于斑马鱼内毒素炎症模型的抗内毒素中药活性筛选及其药效评价方法研究-i奎翘酯苷A、连翘苷、大黄素、黄芩苷对斑马鱼内毒素炎症模型的保护作用将3dpf随机分为阴性对照组(PBS)、LPS组、LPS+3个不同剂量连翘酯苷A组(LPS+FA)、LPS+3个不同剂量连翘苷组(LPS+P烈)、LPS+3个不同剂量大黄素组(LPS+EDN)、LPS+3个不同剂量黄芩苷组(LPS+BAN)、地塞米松阳性对照(LPS+DEX)。造模后，各单