二维斑马鱼模型联合色谱技术高效筛选中药抗骨质疏松活性成分思路和方法

《二维斑马鱼模型联合色谱技术高效筛选中药抗骨质疏松活性成分思路和方法》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、二维斑马鱼模型联合色谱技术高效筛选中药抗骨质疏松活性成分思路和方法［摘要］目的：提出以二维斑马鱼模型联合色谱技术突破评价模型和化合物数量制约，建立高效筛选中药抗骨质疏松活性成分新方法。方法：根据本课题组相关研究及国外有关文献资料，依据斑马鱼骨质疏松模型可高效评价活性，斑马鱼代谢模型可高效富集代谢产物，现代色谱联用技术可高效分离、分析中药成分，提出三者有机联合有望高效解码中药抗骨质疏松体内、外药效物质。结果与结论：该方法使中药成分特别是量微成分与代谢产物的富集、分离分析、在体抗骨质疏松活性筛选简单、高效，充分体现中药药效物质含原形成分及代谢

2、产物，具“多成分，多靶点，整体作用”的特点，为中药抗骨质疏松活性成分的早期、快速发现提供新思路与方法。［关键词］斑马鱼；骨质疏松；药物代谢；色谱联用；活性筛选骨质疏松症是以骨组织显微结构受损，骨矿成分和骨基质等比例的不断减少，骨质变薄，骨小梁数量减少，骨脆性增加和骨折危险度升高的一种全身骨代谢障碍的疾病。抗骨质疏松药物越来越受到重视。但中药成分特别是量微成分的抗骨质疏松活性筛选尚难以简单、高效的进行，主要存在2个瓶颈问题：一是评价模型问题，现有哺乳动物骨质疏松模型耗时长，样品用量大，劳动强度大，效率低，不适于活性高效筛选；现有成骨、破骨细

3、胞以及肿瘤细胞替代模型作用环节单一，难以体现整体观；此外，成本高，实验条件相对苛刻，原代细胞培养难度增加，普通实验室难以进行。二是化合物的数量问题，由于中药成分复杂，药效成分包括原形成分和代谢成分，很难分离到能满足在体活性评价所需的足量化合物，且量微成分及体内代谢成分的富集、分离难度更大。如何突破二者制约，实现中药成分特别是量微成分及其代谢物的抗骨质疏松活性高效筛选具有重要意义。1斑马鱼骨质疏松模型有望突破量微成分难以进行在体评价的技术瓶颈斑马鱼是近年来被广泛用于高通量药效筛选的重要工具。用糖皮质激素诱导的斑马鱼骨质疏松模型，具有化合物用

4、量少（ug〜mg）,简单、高效、高灵敏及低成本的优势，可有效用于中药成分特别是量微成分及其复杂体系的抗骨质疏松活性评价。1.1斑马鱼骨质疏松模型的依据与国内、外研究现状斑马鱼与哺乳动物骨骼生长发育的分子机制极为相似，斑马鱼的骨骼是从3种胚胎干细胞系发育而来，幼鱼骨包含骨形成和骨吸收活动所需的细胞。骨骼形成机制也包括软骨内骨化和膜内骨化，参与调控的关键基因，如Runx2,osteonectin,osteoprogerin等与哺乳动物的相关基因具有高度的同源性⑴。2005年，Fleming等通过对加药后斑马鱼头部骨骼的发育观察，证明斑马鱼模型

5、可以用于筛选促进骨骼发育的药物(维生素D3、依替麟酸等)[2],之后Fleming等用糖皮质激素氢化泼尼松(prednisolone)诱导并建立斑马鱼骨质疏松模型，并证实目前抗骨质疏松常用药物依替麟酸(etidronate)和阿仑呢奈(alendronate)在斑马鱼模型中同样具有明显药效：3-4]o至此，斑马鱼作为高效、快速、高通量筛选促进骨骼生长、治疗骨科疾病药物的在体模型受到研究人员关注[5-7]o目前，斑马鱼骨质疏松模型已被做为比较成熟的、认可的一种在体动物模型用于药物(如licochalconeA)抗骨质疏松作用评价[8]。在国

6、内，斑马鱼做为新型骨骼研究模式生物模型已受到关注[9],本课题组依据国内、外的相关研究基础，提出建立模式生物斑马鱼中药壮骨效应评价新模型。已成功建立糖皮质激素地塞米松和泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松模型，并用于评价依替麟酸二钠及淫羊蕾、续断代表成分的抗骨质疏松活性(图1)[10-12]o1.2斑马鱼骨质疏松模型的特色与优势①用样量少、灵敏度高：药物质量浓度Ug•L-1〜mg•LT,ug〜mg样品足够实验；②高通量：实验在微孔板进行，适合批量筛选;③简单、高效：实验条件简单、易控、易普及；耗时短，约为7〜9d；④成体低：约是大鼠的1/1000

7、；⑤环境条件要求低：不需要超净室，一般具有空调的普通实验室即可进行。2斑马鱼代谢模型可有效用于量微成分的在体代谢，益于代谢产物的高效富集中药体内成分含量低，常釆用体外代谢模型富集代谢产物，如肝细胞、微粒体、代谢酶及肠菌转化等。但肝细胞、微粒体和代谢酶制备相对复杂，保持生物活力条件要求高，肠菌转化基质复杂，不利于代谢产物的进一步纯化，且体外模型作用环节相对单一。斑马鱼代谢模型简单、高效，能模拟哺乳动物进行I相，II相及肠菌代谢及其综合作用，为代谢产物的富集提供新方法、新选择。2.1斑马鱼代谢模型的依据与国内、外研究现状斑马鱼具有完整的器官系

8、统和与哺乳动物相似的基因，具有药物代谢的相关酶系如I相代谢细胞色素P450酶和II相代谢的葡萄糖醛酸转移酶及硫酸转移酶等，此外尚含肠菌代谢的肠道菌群，为其用于药物代谢研究提供了有力依据[13]