《广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
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、符号说明英文缩写英文全称中文全称5，-NTR5'-nontranslatedregion5’一非编码区3，-NTR3'-nontranslatedregion3’一非编码区AREaaAdenosine—uridinerichdements富含腺苷脲苷区域Aminoacids氨基酸BVDVBovineⅥraJDiarrhoeaVirus牛病毒性腹泻病毒BVDV-IBovineViralDiarrhoeaV'mts1牛病毒性腹泻病毒I型BVDV-2BovineⅥralDiarrhoeaVirus2牛病毒性腹泻病毒2型CSFClassicalSwineFeverCSFVClassicalSwineFeverVirusCPEECEndothelialCells猪瘟猪瘟病毒细胞病变效应猪脐静脉血管内皮细胞ELISAEnzymeLinkedImmunosorbentAssay酶联免疫吸附试验FITCFluoresceinIsothiocyanate异硫氰酸荧光素HCLVHogCholeraLapinizedVirus猪瘟兔化弱毒HCVIFAIRESHepatitisCV'misIndirectFluorescentAntibodyTest丙型肝炎病毒间接免疫荧光抗体试验InternalRibosomeEntrySite内部核糖体结合位点NF-r,BNucleartranscriptionfactorkappaB核转录因子PBSPRVSodiumphosphatebuffer磷酸盐缓冲溶液PseudorabiesVirusPRRSVPorcineVimes伪狂犬病毒ReproductiveRespiratorySyndrome猪繁殖与呼吸障碍综合征病PCV二2PorcineCircovirus2TCID50Mediantissue．cultureinfectivedoseTSVT～【PTunisianSheepV'trusTransmembraneprotein毒猪圆环病毒2型组织培养半数感染量突尼斯病毒跨膜蛋白 目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．I英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．IIIl前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．1猪瘟研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．1．1猪瘟概述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．11．1．2猪瘟的一般流行病学⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．21．1．3猪瘟的分子流行病学⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．51．1．4猪瘟在全球范围内的流行现状⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．61．2猪瘟病毒研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．81．2．1瘟病毒属病毒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．81．2．2猪瘟病毒分子生物学特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯81．3猪瘟病毒E2囊膜糖蛋白⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1213．1猪瘟病毒E2基因结构与功能⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．131．3．2猪瘟病毒E2蛋白结构与功能⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．141．4猪瘟病毒发病机理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯161．4．1猪瘟病毒免疫抑制机理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯161．4．2猪瘟病毒与宿主细胞⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．171．5猪瘟病毒检测技术⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯171．5．1病毒分离⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯171．5．2动物试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。_⋯⋯⋯⋯⋯．．181．5．3血清学检测技术⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯181．5．4分子生物学诊断技术⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯192材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2l2．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．21 2．1．1疑似CSF病料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯212．1．2试剂与耗材⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2l2．1．3细胞、毒株和抗体⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2l2．1．4主要的仪器设备与器材⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。⋯⋯⋯⋯．212．1．5实验室常用各种培养基和溶液的配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯222．1．6引物设计及合成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯222．1．7生物信息学分析软件⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯232．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一242．2．1广东省疑似猪瘟样本的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯242．2’2猪瘟病毒流行毒株的分离与培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯282．2．3基于猪瘟病毒流行毒株E2部分基因遗传多样性分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3l2．2．4基于猪瘟病毒流行毒株E2全长基因遗传多样性分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．353结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．393．1广东省猪瘟病毒检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯393．1．1广东省猪瘟疑似样本检测结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯393．1．2猪瘟阳性样本混合感染检测结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯393．1．3猪瘟病毒流行毒株分离鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯413．1．4PK-15与EC细胞猪瘟病毒易感性比较⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．443．1．5F2．F5猪瘟病毒在PK-15增殖特点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯453．2广东省猪瘟病毒流行毒株遗传多样性分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯483．2．1基于猪瘟病毒流行毒株E2部分基因系统进化分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．483．2．22．1c亚亚型流行毒株分支年代的估算⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．493．2．3基于猪瘟病毒流行毒株E2全长基因系统进化分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．513．2．4猪瘟病毒流行毒株E2蛋白氨基酸序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．514讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯58 4．1广东省猪瘟疑似样本检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯584．1．1猪瘟其它三种猪常见病毒病混合感染严重⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯584．1．2猪瘟病毒细胞分离与培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯584．2广东省猪瘟病毒流行毒株遗传多样性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯604．2．1基于猪瘟病毒流行毒株E2部分基因系统进化分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．604．2．22．1c亚亚型流行毒株进化分支年代估算⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．624．2．3基于猪瘟病毒流行毒株E2全长基因遗传多样性分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．635结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．666参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．677致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。⋯⋯⋯⋯⋯．．788攻读硕士学位期间发表的论文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．799附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．80 山东农业大学硕士学位论文中文摘要猪瘟是由猪瘟病毒(ClassicalSwineFeverVirus，CSFV)弓I起的一种猪的高度接触性传染病，每年给养猪业造成严重经济损失。1833年，猪瘟最早发现于美国的俄亥俄洲，此后，亚洲、非洲、拉丁美洲和欧洲等一些主要养猪的国家，相继报道有猪瘟的爆发和流行。除南极洲外，猪瘟的流行几乎覆盖世界范围内各个国家和地区，对养猪业构成严重威胁。世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类传染病并将其纳入必须申报的疫病目录之中，中国也将其定为I类烈性传染病。20世纪90年代末，涂长春研究员及其同事对我国猪瘟进行分子流行病学研究，结果发现在我国流行的基因型有1．1，2．1，2．2和2．3亚型，2．1亚型毒株占主导地位，其中流行于广东省的毒株有2．1b，2．2，2．3和1．1亚型。近几年，陈宁等一些学者研究表明我国东南地区猪瘟流行毒株主要为2．1b毒株。近几十年，大量研究材料显示，猪瘟病毒流行毒株有向II群演化的趋势。在亚洲一些国家和地区包括中国、日本、韩国和台湾地区的猪瘟病毒流行毒株，由于猪瘟疫苗的选择压力等因素发生了转变。这种转变可能跟猪瘟病毒自身对宿主选择压力的适应能力有关。而我国广东省近十几年猪瘟病毒流行毒株流行态势尚不清楚。为了充分掌握我国猪瘟高发地区．广东省猪瘟的流行态势以及CSFV流行毒株的遗传多样性，本研究对2011年来自广东省11个城市所辖区、县的不同猪瘟发病猪场或散养户415份猪瘟疑似样本，通过欧盟猪瘟诊断手册推荐使用的巢式RT-PCR方法进行猪瘟病毒核酸检测，共检出猪瘟阳性样本57份，猪瘟阳性率为13．7％。另外，对于猪瘟病毒检测呈阳性的样本，我们又进行了猪蓝耳病病毒(PI汛SV)，猪圆环病毒2型(PCV-2)和猪伪狂犬病病毒(PRV)，三种猪常见病毒病的检测，57份猪瘟阳性样本中，56份检出猪圆环病毒2型(PCV_2)，34份检出高致病猪蓝耳病病毒(PI汛SV)，1份(GDZC．294)检出猪伪狂犬病毒(PRV)，广东省猪瘟与猪圆环、猪蓝耳病混合感染十分严重，猪瘟与猪伪狂犬混合感染较轻，与其它疾病混合感染是当今广东猪瘟防控严峻的问题之一。通过对巢式RT-PCR产物进行测序，我们获得57条广东省猪瘟病毒E2主要抗原区域编码基因序列，参考GenBank收录的国内外该段基因序列及实验室以前测得的序列，利用系统进化分析软件MEGA5．05针对该段基因(190bp)对广东省CSFV流行毒株构建系统进化树，遗传进化分析表明在该地区流行的毒株除 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查4株为1．1亚型，其余毒株全部属于2．1亚型，以前该地区流行的2．2和2．3亚型毒株在本研究中没有发现。值得注意地是在进行猪瘟监测的地区出现了2个新的2．1亚亚型，即2．1c和2．1d，这些毒株的流行表明该地区CSFV毒株遗传多样性出现了新的变化。为长期保存这些珍贵的生物学材料，为我国广东省猪瘟的防控积累丰富的病毒资源和探索猪瘟病毒在细胞中的适应特点等研究，我们PK．15和EC两种细胞对57猪瘟病毒阳性样本中猪瘟病毒进行了分离与培养，并初步探索两种细胞对猪瘟病毒的易感性分析。通过病毒分离的方法，我们共分离出24株猪瘟病毒流行毒株，除该地区传统经典流行毒株2．1b外，还涵盖新出现的两个亚型毒株2．1c，2．1d毒株，为今后研究该地区猪瘟病毒提供了物质基础。猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2是病毒识别和吸附宿主细胞的病毒结构蛋白，在CSFV增殖过程中具有重要作用，同时，E2蛋白能够诱导机体产生中和抗体，E2的变异与毒株的免疫逃逸有关。为弄清这两种新出现的亚亚型E2基因遗传变异特点，我们从57份样本中选取具有代表性的16份样本，对这些毒株的E2全基因进行扩增、测序，系统进化分析表明16株CSFV流行毒株有15株为基因2．1亚型，另外l株属于基因1．1亚型，结果和根据E2主要抗原编码基因(190bp)分析结果一致。根据E2全基因核苷酸同源性的大小，我们将2．1亚型猪瘟病毒流行毒株进一步划分为4个亚亚型2．1a，2．1b，2．1c和2．1d。其中，2．1c和2．1d亚亚型毒株是首次报道在该地区流行，到目前为止2．1a毒株尚未发现在广东省流行。通过对猪瘟病毒E2基因核苷酸的系统进化分析和氨基酸序列多序列比对，结果表明2．1亚型中4个亚亚型，具有群特异性的氨基酸替换，这些结果进一步证实了2．1亚型的分型结果的正确性。综上所述，我们通过研究覆盖广东省大部分地区，来自不同猪瘟发病猪场或散养户的疑似病料，开展对我国广东省分子流行病学调查工作，基于E2基因序列的系统进化分析和氨基酸多序列比对证明我国广东省CSFV流行毒株遗传多样性发生变化，有新的2．1c和2．1d亚亚型毒株开始在该地区流行，这些研究结果将为我国广东省猪瘟防控策略的制定提供科学依据。关键字：猪瘟病毒；分子流行病学；系统进化分析；E2囊膜糖蛋白；间接免疫荧光抗体试验II 山东农业大学硕士学位论文EpidemiologicalInvestigationonClassicalSwineFeverinGuangdongProvinceAbstractClassicalswinefeverisahighlycontagiousdiseaseofpigscausedbyclassicalswinefevervirus(CSFV)andcausesseriouseconomiclossestopigindustryannually．In1833，classicalswinefeverwasfirstrecognizedinOhiostateoftheUnitedStates．Afterthat，therearemanynewsabouttheoutbreaksandprevalenceofclassicalswinefeverinsuccessioninthemajorpig-raisingcountriesinAsia,Africa,LatinAmericaandEurope．TheprevalenceoftheclassicalswinefeverinvolvingalmostofthecountriesandregionsoftheworldexcepttheAntarctica．Itformedagreatthreattothepigindustryofthosecountries．TheOfficeInternationaldesEpizooties(OIE)hasdesignatedCSFastheclassAinfectiousdiseasesandlisteditintotheOIElist、析tllsomeotherdiseasesthatmustbenotified．InChina,CSFalsohasbeenclassifiedastheclassIinfectiousdiseases．Inthelate1990s，ChangchunTuandhiscolleaguestocarryoutthestudyofmolecularepidemiologyofCSFinChina．TheirstudiesshowthattherearefoursubsubtypesexistinChina,including1．1，2．1，2．2and2．3，amongwhich2．1subsubtypeisdominantstrains．PartofstrainsinhisstudywhichwereprevalenceinGuangdongprovinceincluded4subsubtypes(2．1b，1．1，2．2，2．3)．Inrecentyears，ChenNingandotheracademic’Sstudiesrevealedthatsub-subsubtype2．1bs仃mnsbecamepredominantinsoutheasternChina．Inrecentdecades，AlargenumberofstudiesconfirmedthatCSFVstrainsaredevelopingtothegroupII．CSFVstrainsinsomeAsiancountriesorregionsincludingChina,Japan，SouthKoreaandTaiwan，etal，therehasbeenaswitchinviruspopulationsfromsubsubtype3．4to2．1asaresultoftheselectionforcesofthevaccineorotherfactors．ThisshiftmayrelatedtotheadaptiveabilitiesofCSFVtrainstotheselectionforceswithinthehost．Thepasttenyears，theprevalencetrendofCSFVinGuangdongprovinceisunclear．TofullyunderstandtheprevalencetrendofCSFVandthegeneticdiversityofCSFVfieldisolatesinGuangdongprovince，415CSFVsuspectedtissuesampleswereIII 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查collectedfromdifferentfarmsorbackyardfarmersof1citiesofGuangdongprovince．CSFVnucleicacidwasdetectedbythenestedRT-PCRmethodontheEUclassicalswinefeverdiagnosticmanual．57sampleswereCSFV-positive，theratesofCSFV-positivewere13．7％．Inaddition．anotherthreecommonvirusinpigsincludingPRRSV,PCV-2，PRVweredetectedfromtheCSFV-positivetissuesamplesbyPeRmethod．56outof57CSFV-positivesampleswerePCV-2positive，34sampleswerePRRSVpositive，1sampleWasPRVpositive．TheresultsshowedthatthemixedinfectionofCSFandPRRSV,PCV-2isveryserious，themixedinfectionofCSFandPRVislessserious．ThemultipleinfectionofCSFandotherdiseasesisoneoftheimportantproblemsofthepreventionandcontrolofCSFinGuangdongprovince．Inordertoke印thesepreciousbiologicalmaterialsforalongertimeandaccumulate访fmresourcesforthepreventionandcontrolofCSFofGuangdongprovinceandalsoprovidevirusforthelaterwestudytheadaptiveofCSFVinthePK-15ceilslinesandtheECcellslines．24epidemicCSFVstrainswereisolatedfrom57CSFpositivetissuesamples．Wealsofoundthatthenewcellline(EC)havegoodsusceptibilitytotheCSFV．Except16strainsbelongto2．1bwhichwasthehistoricalCSFVstrains，therearetwonovelsub—subgenotypeSwereisolatedsuccessfully,31strainsbelongto2．1cand4strainsbelongto2．1d．WeprovidesthemostbasicmaterialforthestudyCSFVofthisareainthefuture．AregionencodingthemajorneutralizingepitopesattheNterminusoftheE2geneWasamplifiedbyRT-PCRandthensequenced，weobtained57sequences．52referencestrainsequencesweregotfromtheGenBankdatabaseandtheother17referencestrainsequencesWaspreviouslysequencedbyChangchunTu．PhylogenetictreeswereconductedbythesoftwareMEGA5．05basedontheregionencodingthemajorneutralizingepitopesofE2gene．Phylogeneticanalysisshowedthat4outof57isolatesbelongedtosubgenotype1．1，and53isolatebelongstosubgenotype2．1．Thesubgenotypeof2．2，2．3previouslyprevalenceinthisareawerenotfoundinourstudy．NotablythatattheCSFVmonitoringregionsthereweretwonovel2．1sub-subgenotypes，2．1cand2．1d．TheprevalenceofthesestrainsrevealedthatthegeneticdiversityhavechangedinGuangdongprovince．IV 山东农业大学硕士学位论文TheenvelopeglycoproteinE2whichisoneofthestructuralproteinsofCSFVisessentialforvirusattachmentandrecognizedthetargetcells．ItalsoplayshingerolesinlifecycleofCSFV．E2Caninduceneutralizingantibodies．ThevariationofE2isrelatedtoimmuneescapeofthevirus．InordertoclarifythecharacteristicsofthevariationofE2geneof2．Icand2．1d．Weselected16tissuesamplesrepresentativefromthe57CSFpositivetissuesamples，thefull—lengthE2geneof16CSFVisolateswasamplifiedbyRT-PCRandthensequenced．PhylogeneticanalysisbasedonthenucleotidesequenceofE2geneshowedthat15outof16isolatesbelongtosubgenotype2．1，andoneisolatebelongstosubgenotype1．1．TheresultsarethesameofthatbasedontheregionencodingthemajorneutralizingepitopesofE2gene．These2．1isolatesCanbefurtherdividedinto3sub-subgenotype2．1b，2．1cand2．1daccordingtothenucleotidesequencesimilarity,thelasttwosub-subgenotypeswerefirstreportedinthisprovince．andthereisstillnoevidencefor2．1ainGuangdong．Multiplesequencealignmentrevealedthatallsub-subgenotype2．1b，2．1eand2．1dcontaingroupspecificaminoacidsubstitutions，whichfurtherconfirmthegenotypingofsubgenotype2．1．Overall，wecarryoutthemolecularepidemiologicalinvestigationofCSFVofGuangdongprovince，byanalysising415suspectedtissuesamplesfromdifferentareascovermostofGuangdongprovince．ThisstudyprovidesallevidenceforthepresenceofdifferentsubgenotypesofCSFVfieldisolatesinGuangdongprovince，especiallytheepidemicsof2．1cand2．1disolates，thisresultmaybehelpfulforthedevelopmentofpreventionandcontrolstrategyofCSFinGuangdongprovince．Keyword：classicalswinefevervirus；molecularepidemiologieal；phylogenetieanalysis；theenvdopeglyeoproteinE2；IndirectfluorescentantibodytestV 山东农业大学硕士学位论文1．1猪瘟研究进展1．1．1猪瘟概述-▲上．-J一刖置猪瘟(ClassicalSwineFever，CSF)俗称“烂肠瘟”，是由猪瘟病毒(ClassicalSwineFeverVirus，CSFV)引起家猪和野猪以出血、免疫抑制、高热，并伴随肠道症状为主要发病特征的一种急性接触性传染病(Moermig，2000)，对世界养猪业构成严重威胁。国际兽医局(OIE)将其纳入必须申报的A类动物传染病目录，我国也将其列为I类传染病。猪瘟病毒经口鼻途径入侵宿主猪体内，通常在扁桃体腺窝上皮细胞进行复制。感染初期猪瘟病毒侵袭单核细胞和粒细胞，随后通过血液循环导致局部淋巴结乃至全身感染(Summerfield等，1998；Susa等，1992)。猪感染病毒后表现为高热、白细胞急剧减少、免疫功能抑制、器官呈现出血和淤ffll(Moennig等，2003；Moennig等，1992)等，并继发其它病原体的感染，因此死亡率极高。猪瘟于1833年首发于美国的俄亥俄洲；1885年Salmon和Smith首次阐明猪瘟是一种由霍乱沙门氏菌引起的细菌性疾病，并于1886年将猪瘟与猪丹毒和霍乱沙门氏菌病区分开来；1903年美国兽医学家德希尼兹和多赛特鉴定本病的病原是黄病毒科瘟病毒属(胁疗v护淞)中的猪瘟病毒。目前猪瘟广泛分布于欧洲、亚洲、中南美洲的大部分养猪国家。许多国家如澳大利亚、爱尔兰、加拿大、新西兰和美国等在实施屠杀和强制免疫后都曾宣布消灭了猪瘟。但近年来，一些宣布已消灭猪瘟的国家如德国、荷兰、比利时等又见猪瘟的报道(Stegeman等，2000)，在加勒比海地区的国家、马达加斯加岛和南非也相继出现猪瘟流行的报道(Sandvik等，2005)。我国自1954年兔化弱毒疫苗的问世，猪瘟大规模爆发流行受到有效地控制。但近50年来，猪瘟在我国大部分地区仍有流行且呈现不同以往的发病特点，主要表现为：发病年龄偏小，临床表现温和，垂直传播、持续性感染、混合感染以及免疫抑制更为严重。猪瘟的流行酿成全球养猪业惨重的经济损失。1963．1966年间，英国为消灭猪瘟耗资1200万英镑；1962．1978年间，美国为此花费1．4亿美元；1983．1984年间，荷兰为控制猪瘟耗资1．27亿荷兰盾；1990年，比利时爆发猪瘟造成2．7亿美元经济损失达；1997年荷兰爆发猪瘟导致七百万头猪被扑杀，后该猪瘟传入比利时，带来惨重的经济损失(Elbers等，1999)。 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查1．1．2猪瘟的一般流行病学1．1．2．1猪瘟病毒传播过程猪瘟病毒的易感动物是家猪和野猪，以猪只的直接接触为主要传播方式，也可通过消化道、破损皮肤、输精等途径进行传播。在德国90年代(1990—1997)每年爆发流行猪瘟当中，相当一部分是进行人工受精采用了感染猪瘟病毒的精液(Fritzemeier等，2000)。由于国际贸易往来日益频繁，猪及相关动物产品的跨地区输出成为猪瘟病毒远距离传播的重要途径，也是猪瘟病毒传入无猪瘟国家或地区的主要原因。1997．1998年，欧洲大规模爆发猪瘟的根源就是运输感染猪瘟病毒猪只的工具消毒不彻底，加之欧洲时处冬季，适宜的气温等为猪瘟病毒的存活提供了有利的条件，进而导致约1．1亿头猪被屠杀(Elbers，1999)。低毒力猪瘟病毒感染妊娠母猪后可突破胎盘屏障感染胎儿，垂直传播给仔猪，再由仔猪水平传播给其它猪只。猪只感染猪瘟病毒后，无论病毒毒力强弱，至猪只死亡前，均可长期大量经口、鼻、眼泪、尿液、粪便向外排泄病毒。在高密度饲养猪只地区，人为的机械传播具有重要意义。据统计，1971．1974年德国Hessen地区40％的猪瘟传播是人为所致。猪瘟病毒亦可经空气传播，但欧洲等国颁布的扑杀政策明确规定以发病点为中心，500米为半径地区范围内的所有猪只均要强制扑杀，所以这一传播途径在欧洲等发达国家完全被阻断(Fritzemeier,2000)。除家猪外，野猪是猪瘟病毒的重要自然宿主，猪瘟病毒可在其循环传播(Depner等，2000)。野猪感染猪瘟病毒是由感染猪瘟病毒的半放牧饲养家猪传播而来，野猪又可通过直接接触或者食物链将病毒传播给家猪，形成恶性循环(Lowings等，1999)。1990．1998年间，德国爆发的猪瘟中4．7％．60％是由野猪传播病毒造成的。猪瘟病毒的分子流行病学数据表明，在萨丁尼亚家猪中的流行毒株与当地野猪独特的流行毒株属于同一个基因亚型，均为基因2．3型，并且毒株之间同源性很高(Greiser-Wilke等，2000)．在德国、奥地利、俄罗斯、斯洛伐克等欧洲国，当地野猪在未接种疫苗情况下猪瘟抗体检测呈阳性，后从野猪体内分离出猪瘟病毒(Laddomada,2000)。猪瘟病毒一般无明显细胞病变，但有报道称在野猪体内可分离出引起细胞病变的猪瘟病毒(Aoki等，2001)。。1．1．2．2猪瘟流行病学特点的变化猪瘟病毒的毒力决定猪瘟的流行形式：大规模流行性是由强毒株引起，地方性流行性是由中等毒力毒株感染所致，仔猪先天性感染则是由低毒力毒株引起。猪瘟一年四季都可爆发，各种年龄猪均可发病，典型猪瘟流行初期仅少数猪只发病，1．2周后会出现 山东农业大学硕士学位论文大规模流行(蔡宝祥，2001)。从上世纪70年代末开始，世界范围内猪瘟流行病学特点发生了巨大变化，主要变现为：在发病特征上以温和型为主；在流行形式上呈周期性、波浪形地区散发，通常3．4年一个周期；全球疫点明显减少，一些经济相对落后的原猪瘟疫源地如墨西哥等发展中国家已大力开展根除猪瘟计划，宣布已根除猪瘟的国家数量不断增加。但近几年我国猪瘟疫情有反弹迹象，表现出比以往更为复杂的情况：在流行形式上呈区域大规模流行与散发并行；在疾病表现上既有顽固持续发生的温和性症又有高死亡率的急性症状；在发病特点上以“非典型性猪瘟”为主：发病年龄跨度大，以3月以内仔猪最常见；发病无季节性且传播途径不明，具有散发性和地方流行性；常继发其它病原体感染且并发症较多；发病率和死亡率显著降低，但潜伏期和病程明显延长；发病临床症状不典型，皮肤密布出血斑点、高热、结膜炎和严重下痢等典型猪瘟症状极少出现，多表现为中低热、四肢发绀、精神沉郁、喜聚堆、厌食、消瘦和粪便干硬等；剖检后典型的猪瘟病理变化如淋巴结、肠道、脾脏和肾脏等多器官同时出血病变以及扣状肿等并不出现，仅表现为个别器官的病变；猪瘟病毒可通过胎盘屏障感染仔猪，造成流产、死胎、木乃伊胎、畸形胎、滞留胎；持续感染母猪所产的幼仔常外表健康，但体内携带猪瘟病毒并伴有先天性颤抖，这些仔猪体内猪瘟抗体滴度较低或呈半免疫状态，发病时无明显症状，随后出现精神沉郁、食欲减退、被毛松乱、皮炎、结膜炎、便秘与腹泻交替出现、运动共济失调，躯体麻痹直至死亡；用抗生素及磺胺类药物治疗无明显效果。猪群的结构、密度以及动物贸易的频繁化是影响猪瘟流行病学的重要因素。近几年一些欧洲国家农场在改良养殖条件的同时，采取猪高密度集养殖措穷缸，这会导致在该地区猪瘟首次爆发流行后继续蔓延的概率远高于低密度地区；此外，由于猪及相关动物产品的跨区域输出与日俱增，使得猪瘟传播感染情况变得更严重。因此，掌握动物贸易与养殖场密集相关的准确信息尤为重要(黄瑜等，1994)。野猪和家猪均是猪瘟病毒的易感动物，野猪群的密度和活动等也是猪瘟流行的重要因素。在一些家猪未感染猪瘟病毒的国家，野猪群中流行猪瘟的主要原因是食用了不洁净的猪食所导致，流行于野猪群的猪瘟病毒作为一种永久储存病毒不断威胁家猪的生存。近年来，意大利、法国和瑞士等西欧国家野猪群中相继出现猪瘟的爆发流行，甚至在德国某些地区猪瘟病毒从野猪群传染给了家猪。目前曾爆发过猪瘟的西欧国家几乎都建立了针对野猪猪瘟检测程序(Moennig，2000；邱昌庆，2002；赵耘等，2004)。1．1．2．3影响猪瘟流行的因素 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查在欧洲等国，猪瘟主要源于野猪，此外动物性产品贸易也加剧了猪瘟病毒的传播；对美国等无猪瘟的国家，为杜绝输入性病例的发生，进口贸易检疫应是防护的重中之重；在猪瘟疫原地的发展中国家，影响猪瘟流行的因素就较为复杂：预防接种不切实(蔡宝祥，2002；邓水生等，2004)：(1)疫苗质量问题：目前我国使用的猪瘟疫苗是兔化弱毒疫苗，即使经过病毒弱化但仍有较强毒力。再者，疫苗要经过多家供应单位且反复冻融多次才可投入使用，漫长的运输过程和反复波动的温度势必影响疫苗效价。研究表明，疫苗于20。C保存时间越长效价越低。此外，我国部分疫苗生产商生产的疫苗不符合国家标准甚至有失真空现象。接种此类疫苗产生的免疫力难以抵抗强毒攻击，造成免疫猪发生猪瘟亚临床感染。(2)联苗免疫效果不理想：如我国部分疫苗生厂商生产的“猪瘟．丹毒．肺疫三联苗"和“猪瘟．丹毒二联苗"中含有吐温．80成分，严重干扰猪瘟疫苗的免疫效果。(3)免疫程序不当：免疫程序优良与否是免疫成败关键所在。适合的免疫程序是在排除母源抗体干扰的基础上确定仔猪首免日龄。母源抗体具有双重性，即一方面对仔猪起保护作用，另一方面会抑制仔猪的免疫效果。因此为获得良好免疫效果，在实旌接种时应综合考虑疫苗质量、母源抗体滴度和整齐度等因素：当母源抗体滴度过高时，接种的疫苗病毒会被其中和而丧失保护作用；带毒母猪以及反复接种疫苗但依然保持低抗体水平的母猪应彻底淘汰。(4)免疫接种剂量不达标：仔猪在45日龄时，分别用1头份、2头份和4头份猪瘟疫苗进行免疫，结果表明：接种4头份猪瘟疫苗的仔猪可肥育至出栏即此免疫接种剂量免疫确实。但目前我国多数地区免疫接种量为1头份，该剂量疫苗所产生的抗体无法阻止强毒在体内复制，实现保护猪群的目的。猪瘟病毒毒力变异：研究表明，猪瘟病毒无血清型之分仅存在致病力强弱之分。由猪瘟病毒中分离出的低毒力毒株可经动物传代后毒力增强。这一现象表明猪瘟病毒在免疫压力下其致病力和抗原的特征有所改变，这也是造成疫苗免疫效果不理想的原因之一。猪瘟弱毒疫苗的返强：猪瘟弱毒疫苗对控制猪瘟的流行起到了举足轻重的作用，但此类疫苗所产生的保护性抗体并不能彻底切断猪瘟病毒的传播途径。猪瘟野毒不仅存在还以低水平在传播，弱毒疫苗也存在基因突变或与猪瘟野毒发生基因重组而导致毒力逆强的风险。牛病毒性腹泻病毒的干扰(韩雪清等，2002；钱年华等，2003)：资料显示，牛病毒性腹泻病毒(BVDV)与猪瘟病毒(CSFV)均是黄病毒科瘟病毒属成员，它们具有共同的抗原。4 山东农业大学硕士学位论文猪瘟病毒株按照毒力的强弱可分为B群和H群，将牛病毒性腹泻病毒抗血清分别与其进行中和试验：BVDV抗血清可中和弱毒株B群，导致慢性猪瘟；但BVDV抗血清无法中和强毒株H群。换言之，BVDV抗血清仅可抵抗B群CSFV无法抵抗H群CSFV。当进行CSFV免疫时，BVDV可能对其产生干扰作用，使CSFV疫苗免疫活性降低。种猪与仔猪带毒、排毒(龚真莉等，2007)：母猪在妊娠前30日、10．50日、20．97日、30．100日接种疫苗可引起胎盘感染和母猪繁殖障碍，仔猪即使存活也长期带毒和排毒即变为亚临床感染者，极易导致非典型猪瘟的发生；感染母猪对猪瘟疫苗的特异性免疫应答水平低，并可将病毒传播给仔猪进而引发非典型猪瘟。1．1．3猪瘟的分子流行病学分子流行病学是以先进的分子生物学技术和生物信息学为依托，发展起来的一种能够从分子生物学水平阐明疾病发展的原因，发病过程及发病机理，从而为疾病的防控提供指导意义。猪瘟病毒只有一个血清型，基因分歧范围减小，此外，有研究表明CSFV流行毒株不同的基因型在临床上表现的症状是不同的(Kaden等，2000)，因此系统进化分析常用作CSFV分子流行病学研究。1994年，Lowing等(Lowings等，1994)首次将系统进化分析应用到CSFV分子流行病学研究，根据E2主要抗原区域基因对CSFV基因的分型，并且证明此方法比以前采用的抗原分型等方法具有更高的准确性。遗传进化分析可以对CSFV进行基因精确分型，追踪CSFV流行毒株来源，揭示CSFV流行途径，发现CSF防控的薄弱环节，还能够实时监测CSFV的时空演化和流行趋势。1996年，Lowing等(Lowings等，1996)根据E2主要抗原编码基因和编码NS5B聚合酶区基因片段(409nt)对世界上20多个国家的1945—1997年间的115株CSFV流行毒株进行遗传进化分析将CSFV划分为两个大群和5个亚群，其中上世纪80年代以前在亚洲流行的CSFV毒株和欧洲古老CSFV毒株中大多为I群，而当时在欧洲流行的CSFV流行毒株中大多属于II群。2000年，Paton等(Paton等，2000)根据CSFV的5'-UTR基因的150nt、E2主要抗原编码基因190nt和聚合酶NS5B基因409nt将CSFV划分为3个基因群(I一Ⅲ群)和10个基因亚群(1．1．1．3，2．1—2．3，3．1—3．4)，其中在欧洲1920．1970年间的流行的毒株为基因I群，1980．1990年间在欧洲流行的毒株为基因II群。2．1亚型最早发现在亚洲的马来西亚，分子流行病学表明在欧洲这种亚型只是零星的流行，1997．1998年，2．1亚型引起欧洲猪瘟的大规模流行，先后从德国传到荷兰，随后蔓延至意大利，比利时和西班牙，欧洲的CSFV爆发出现新的态势，对于该地区猪瘟防控有效 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查措施的制定具有十分重要的意义。通过系统进化分析还发现CSFV流行毒株基因型成地域性分布，例如3．4亚型独特型CSFV主要分布在亚洲的日本、韩国、台湾、泰国，1．3亚型主要分布于洪都拉斯，古巴主要为1．2亚型毒株。根据CSFV核苷酸同源性，建立起不同毒株之间的亲缘关系，对追溯毒源具有重要的意义，1993年，发现奥地利的2．1亚型毒株可能通过感染的野猪肉由中国传入。系统进化分析常用于CSFV遗传多样性分析，这对于猪瘟防控策略的制定具有指导意义。涂长春研究员对我国CSFV进行流行病学调查发现，我国CSFV存在遗传多样性，2．1亚型毒株据主导地位，陈宁等研究证明2．1b是我国东南地区优势流行毒株。Suzuki等(Suzuki等，1999)研究表明E2蛋白具有两个适应性进化位点，因此对猪瘟病毒展开分子流行病学调查，对推测猪瘟病毒流行毒株进化方向具有十分重要的意义。此外，根据CSFV的一段基因序列，还能够对某一基因型的毒株进化分支年代进行分析，可以大致估算这种流行毒株在当地流行的时间。近二十年，CSFV病毒分子流行病学成为有效控制猪瘟病毒的有效工具，选取不同的基因片段对CSFV进行系统进化分析是研究CSFV病毒分子流行病学调查最基本的手段。1．1．4猪瘟在全球范围内的流行现状猪瘟(ClassicalSwineFever,CSF)是由猪瘟病毒(ClassicalSwineFeverVirus．CSFV)引起家猪和野猪患病的一种高度接触性传染病，以高发病率和死亡率为主要特征，急性感染常表现发热、出血、呼吸困难、共济失调和，有的表现胃肠道症状，死亡率极高，给全球的养猪业带来巨大经济损失。国际兽医局(OIE)将其纳入必须申报的疾病目录当中，我国也将其列入必须检疫的疾病。关于猪瘟的起源公认是，1833年，最早被发现于美国的俄亥俄洲，还有一些学者认为是1822年最早在欧洲的法国被报道，美国的猪瘟可能从欧洲引入。自1903年，Sel掣weinitz等(De8chweinitz等，1903)1正N该病病原为病毒，此后的_一个多世纪，：猪瘟的流行几乎遍及全球各地。欧洲的中部和东欧许多国家包括阿塞拜疆，阿尔巴尼亚，白俄罗斯，保加利亚，捷克，克罗地亚，爱沙尼亚，匈牙利，拉脱维亚，立陶宛，马其顿，摩尔多瓦，波兰，俄罗斯，斯洛伐克，斯洛文尼亚和乌克兰等国在1993．1997年间均有猪瘟的爆发和流行，欧盟一些国家发达的国家包括德国，比利时，荷兰，意大利，1995．1998年也报道有猪瘟流行(Edwards等，2000)。Vil芒ek等(Vil芒ek等，1996)i正明欧洲古 山东农业大学硕士学位论文老猪瘟病毒毒株大多为I群，目前在欧洲流行的猪瘟病毒多为II群，最近在欧洲一些国家爆发的猪瘟多为2．1亚型有关。北美洲的加拿大和美国猪瘟基本根除外，中美和南美洲各国几乎都有猪瘟的分布，特别是加勒比海群岛包括古巴，海地和多米尼加都是猪瘟的高发地区(Pereda等，2005)，这些地区的猪瘟病毒流行毒株多为I群(1．2-1．4)。亚洲是猪瘟高发的地区，在日本，自1888年首例猪瘟爆发后，此后有多起猪瘟爆发的报道，这些猪瘟的爆发多与亚洲独特种群ⅡI群有关，但是1986年之后，该地爆发的猪瘟主要为II群毒株引起，同样的情况发生在台湾，3．4亚型毒株在台湾的流行最早可追溯到上个世纪20年代，并且一直是该地区优势流行毒株，由于LPC疫苗的长期使用，1996年后，2．1亚型毒株取代3．4亚型毒株成为台湾优势流行毒株(Sakoda等，1999)。在韩国首例猪瘟爆发是在1947年，一直到1996年实施猪瘟根除计划不断有猪瘟的爆发，多为IⅡ群猪瘟病毒引起的爆发，但是2002年4月，又发现猪瘟的流行，并且呈严重趋势，Cha等对这些毒株进行系统进化分析证明新爆发的猪瘟跟2．1亚型有关(Cha等，2007)。台湾东南亚各国，除新加坡外，包括，老挝，泰国，印度均是猪瘟高发地区。蒙古和朝鲜缺乏这方面的数据。2001年，涂长春研究员等(Tu等，2001)率先对中国大陆地区27个省份和直辖市进行猪瘟流行病学调查，证明我国主要有四个基因型(1．1、2．1、2．2、2．3)，与Lowings等得出上世纪80年代亚洲猪瘟流行毒株主要为I群的结论不同的是，2．1亚型成为我国最主要的基因型。我国的2．1亚型毒株主要以2．1b为主，只有少量的2．1a分布四川，贵州，云南，广西和湖南。特别是自上世纪五十年代，猪瘟兔化弱毒疫苗的应用，很好的控制了猪瘟在我国的大规模流行，但是由于疫苗的选择压力等因素，我国的猪瘟流行特点发生了很大的变化，以低死亡率，散发，温和性为特点的非典型性猪瘟成为我国主要的流行形势，这种特点的变化可能跟2．1亚型的流行有关。1985—2002年间，涂长春等(Tu，2001)对我国广东省流行的CSFV流行毒株进行测序，共获得29条猪瘟病毒流行毒株E2主要抗原编码基因序列，通过系统进化分析结果表明10株为1．1亚型，19株为2．1亚型，4株为2．2亚型，5株为2．3亚型。华南农业大学的学者通过系统进化分析显示其在2008．2010年从广东省分离的14株CSFV流行毒株都属于基因1．1亚型(Shen等，2011)。 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查1．2猪瘟病毒研究进展1．2．1瘟病毒属病毒瘟病毒属(GenusPestivirus)成员主要有猪瘟病毒(ClassicalSwineFeverVirus．CSFV)，牛病毒性腹泻病毒1型(BovineⅥralDiarrheaVirusl，BVDV-1)，牛病毒性腹泻病毒2型(BovineⅥralDiarrheaVirus2，BVDV-2)，羊边界病病毒(BorderDiseaseVirus，BDV)四个确定种，及以从肯尼亚长颈鹿中分离出的H138株为代表的长颈鹿瘟病毒(Pestivimsofgiraffe)第五个暂定种组成(Plowright，1969；Thiel等，2005)。最近几年，新的瘟病毒属成员不断的被发现，2004年，Schirrmeier等(Schirrmeier等，2004)从巴西一批牛血清中分离得到D32／00HoBi株。2005年，Stalder等(Stalder等，2005)分别从水牛及被小牛血清污染的细胞培养物中分离得到Brzbuf9株和CH．KaHo／cont株。2007年，Stalll等(Sffthl等，2007)从泰国自然感染的小牛的血清中分离得到刚04KhonKaen株。Liu等(Liu等，2009)通过系统进化分析将D32／00HoBi株，Th／04KhonKaen，CH．KaHo／cont划为BVDV-3，与突尼斯羊病毒(TunisianSheepVirus，TSV)(Thabti等，2005)同时划分成瘟病毒属两个新的成员。瘟病毒属成员之间基因组结构具有很高的相似性，血清学上存在广泛的交叉反应。1．2．2猪瘟病毒分子生物学特性猪瘟病毒(ClassicalSwineFeverVirus，CSFV)又称猪瘟病毒(HogCholeraVirus，HCV)，为了避免与丙型肝炎病毒(HepatitisCVirus，HCV)混淆，故改用猪瘟病毒(ClassicalSwineFeverVirus)。CSFV为单股正链RNA病毒，病毒粒子呈球状或椭圆，正二十面体对称结构，有囊膜，直径大小40～50nm，基因组全长约12300核苷酸，两端分别为5’．端非编码区(5'-nontranslatedregion，5’-NTR)和3’．端非编码区(3'-nontranslatedregion，3’-NTR)，5’．端无甲基化形成的帽子结构，3’．端无多聚腺苷酸(polyA)尾，中间为独立开放的阅读框架(ORF)，负责编码一条大概有3898个氨基酸残基的多聚蛋白(MeyersThiel，1996)。该多聚蛋白经羰基化后由病毒自身Npro蛋白和细胞内蛋白酶类裂解成4个结构蛋白(C、Eros、E1和E2)和8-9个非结构蛋白(Npro、P7、NS2．3、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)(Rumenapf等，1993；Tautz等，1997；Tautz等，1993；Thiel等，1989)。见图1 山东农业大学硕士学位论文II,、≈pp。龄≯≯‘图l猪瘟病毒基因组结构及编码蛋白(MartinB，等2007)Fig．1GenomestructureandencodingproteinsofCSFV(MartinB，etal2007)1．2．2．1猪瘟病毒5’．端非编码区5’。端非编码区(5'-nontranslatedregion，5'-NTR)大约有373个核苷酸，上面含有多个颈环结构的结构域和多个多聚蛋白合成的AUG密码子，5’-NTR具有促进病毒多聚蛋白在内核糖体进行翻译的功能。大多数真核mRNA有效的转录过程，需要帽结合复合物elF4F作为真核起始因子，而猪瘟病毒可以不依赖真核起始因子elF4F独立行使翻译过程，是因为CSFV的5’-NTR的内部核糖体结合位点(IntemalRibosomeEntrySite，IRES)能够利用核糖体43s起始前体复合物直接充当起始密码子，这个过程当中起关键作用的是IRES与核糖体40s亚单位直接结合形成一个稳定的二聚体复合物，能够将起始密码子准确定位于核糖体P位点，驱动mRNAs的翻译过程。IRES长度约330个核苷酸，高度结构化，介导翻译的起始，其5’．端起始于第28．66位核苷酸(Kolupaeva等，2000)。IRES的核心位于第1Ⅱ结构域内，IⅡ结构域形成的一个假结节结构是激活IRES活性所必须的。尽管不同毒株的5'-NTR序列有所不同，但是5'-NTR的二级和三级结构非常保守，人们常将5’-NTR序列用于猪瘟病毒的遗传进化分析。1．2．2．2猪瘟病毒3’．端非编码区猪瘟病毒3’．端非编码区(3’nontranslatedregion，3’-NTR)长度在230．244个核苷酸之间，上面含有猪瘟病毒复制酶的识别位点，启动负链RNA的合成(Cheng等，2002；XiaoM等，2004)，3'-NTR能够通过与5’-NTR相互作用和通过其他方式影响翻译过程(Ito等，1998)。3’-NTR还参与猪瘟病毒的复制，Behrens等(Behrens等，1998)发现缺失3’-NTR的猪瘟病毒无法进行复制，此外，Xiao等(XiaoM，2004)证明3’-NTR上面 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查一段21个核苷酸序列为CSFV复制所必须的。此外，还有人证明3’-NTR还跟CSFV的毒力有关，猪瘟病毒兔化弱毒株(HCLV)跟我国强毒株shimen株相比，在3’-NTR第12133核苷酸处，多了12个碱基(CTTmCTTTT)，这导致了HCLV株毒力的减弱有关(XiaoMing等，2004)。Nadar等(Nadar等，2011)研究表明猪瘟病毒3’-NTR有一段富含腺苷和脲苷的区域(Adenosine-uridineRichElements，AI冱)，HuR蛋白能够与ARE区域发生特异性结合，具有保护mRNA降解的作用。1．2．2．3Npro蛋白Npro蛋白为CSFV非结构蛋白，又称前导蛋白，属木瓜蛋白酶族成员(Piccone等，1995)，是ORF编码的第一个蛋白，由168个氨基酸残基组成，编码基因为504个核苷酸，属内保守。Npro蛋白本身是一个自体蛋白酶(autoprotease)，具有酶原活性，在Cysl68和Serl69之间有一个水解位点，水解后与核衣壳蛋白C使之分离开来(Stark等，1993)。Npro蛋白同时又是一种新型半胱氨酸蛋白酶，与枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶(subtilisin．1ikeprotease)具有一定的相似性(Rtimenapf等，1998)，能够使真核细胞起始因子4G的220kDa亚单位蛋白降解，从而使帽依赖宿主细胞蛋白合成系统关I翊(Devaney等，1988)。非结构蛋白Npro还与病毒的毒力有关，MayerD等(Mayer等，2004)分别缺失中等毒力Alfort／187株，高致病力Eystrup株两病毒株的Npro基因后，两株毒株的毒力均减弱，用这两株缺失突变株攻击猪体后均可诱导产生强烈的免疫反应。Tratschin等(Tratschin等，1998)用小鼠泛素基因替换非结构蛋白Npro编码基因发现对病毒在细胞培养过程中的复制影响不大，推测Npro蛋白不是病毒复制必需的蛋白质。Ruggli等(Ruggli等，2005)研究证明Npro蛋白是双链RNA介导的细胞凋亡，IFN．a，IFN．B诱导的拮抗剂。Doceul等Npro蛋白与宿主细胞NF—kappaB的抑制因子IkappaBalpha能够相互作用。1．2．2．4NS2．3蛋白猪瘟病毒的NS2．3蛋白有三种存在形式，用不能致细胞病变的毒株感染细胞，仅以NS2．3前体形式存在。能够使细胞发生病变效应的毒株，感染细胞中NS2．3蛋白在蛋白酶的作用下进一步被加工成NS2和NS3两种单体形式，有的细胞中NS2、NS3、NS2．3中间体三种形式同时存在。最近有研究证明只有单体蛋白NS2或NS3具有自体蛋白酶活性。NS2蛋白其编码基因长度约1365核苷酸，是高度疏水性蛋白，并参与病毒的复制。上面至少四个跨膜区和两个内置信号肽序列(103．138aa和220．262aa)，在内质网转移过程发挥关键作用(Guo等，2011)。Tang等(Tang等，2010)构建NS2稳定表达的猪脐静脉 山东农业大学硕士学位论文血管内皮细胞系，观察到周期蛋白A显著增加，能够诱导细胞周期阻滞于S期，NS2蛋白同时能够诱导内质网应激，并激活核转录因子(NucleartranscriptionFactorkappaB，NF．1(B)。NS3蛋白编码基因长度为2043核苷酸，CSFV一个多功能非结构蛋白，参与蛋白的翻译和病毒的复制，对宿主细胞的病变也发挥重要作用(Gu等，2000)，其本身又是一种自体水解蛋白酶，同时具有RNA解旋酶，核酸三磷酸酶和丝氨酸蛋白酶活性。其中RNA解旋酶，核酸三磷酸酶活性区域位于C端某区域，丝氨酸蛋白酶核心区域位于N端1／3处，参与病毒的复制。此外，NS3蛋白能够诱导机体产生抗体。1．2．2．5其他非结构蛋白NS4A蛋白编码基因192核苷酸，共64氨基酸残基，由NS3蛋白水解酶从多聚蛋白水解下来，具有辅助NS3蛋白发挥丝氨酸蛋白酶活性的作用(Xu等，1997)。在感染的细胞中NS4A是NS2．3中间体形成不可缺少的一个辅助因子，两者在传染性病毒粒子的形成至关重要(Moulin等，2007)。NS4B蛋白为350氨基酸残基，编码基因1050核苷酸，为内质网相关联的嵌膜蛋白，包含4个假定的跨膜区域，C端区域有两个预测的螺旋区域，N端区域有一保守的双亲性螺旋，能够裂解为一个跨膜区域(Lundin等，2003)。NS4B蛋白能够形成一个特定的可变性网状膜结构，以促进病毒RNA的复制(Egger等，2002)。最近的研究表明NS4B蛋白N端有一段20个氨基酸序列与病毒功能性复制复合物形成有关(Gouttenoire等，2009)。NS5A蛋白由497氨基酸残基组成，能够调节病毒和宿主细胞信使RNA的转录，与牛病毒性腹泻病毒NS5A蛋白作用相似在调节宿主细胞内环境和病毒复制机制有关(Tellinghuisen等，2006)。此外，Xiao等CXiao等，2009)研究证明NS5A氨基酸残基中390--414aa缺失能够抑制猪瘟病毒IRES介导的翻译过程。NS5B蛋白为718或719个氨基酸残基，能够与正链和负链的3’-NTR结合，该蛋白有RNA依赖的RNA酶活性，是CSFV复制酶，在病毒的增殖过程中发挥重要作用。NS5B蛋白编码基因为2154核苷酸序列，瘟病毒属内高度保守，常用作系统进化分析。P7蛋白介于囊膜糖蛋白E2和NS2蛋白之间，仅70个氨基酸残基组成的一个小蛋白，由宿细胞信号肽酶从多聚蛋白水解下来，但是不完全断裂容易形成E2-P7蛋白，因此感染CSFV的细胞中常存在E2和E2．P7两种蛋白，但是P7不是CSFV的结构蛋白，同其它非结构蛋白一样与感染性CSFV粒子形成有关(Elbers等，1996)。1．2．2．6核衣壳C蛋白 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查核衣壳C蛋白是CSFV首个结构蛋白，起始于Serl69，终止于Ala267，共99个氨基酸残基，编码基因长度为297个核苷酸。核衣壳C蛋白由Npro蛋白酶和信号肽酶从多聚蛋白裂解下来(Heimann等，2006)，是构成病毒粒子骨架不可缺少的成分，在病毒生命周期中发挥至关重要的作用。C蛋白一些抗原表位能够介导T淋巴细胞和B淋巴细胞介导的免疫反应，但不能诱导机体产生抗体。有研究表明C蛋白对宿主细胞的转录过程具有调控作用(Liu等，1998)，还能够与宿主细胞内泛素化蛋白(SUMOylationprotein)相互作用(Gladue等，2010)。Gladue等(Gladue等，2011)研究证明C蛋白与细胞IQGAPl蛋白相互作用决定病毒在猪内毒力。1．2．2．7Eros蛋白囊膜糖蛋白Eros又称E0，是CSFV又一个重要的结构蛋白，是CSFV三个囊膜糖蛋白当中唯一一个具有核糖核酸酶活性的蛋白质，常以同源二聚体形势存在于病毒粒子表面或细胞膜上(Langedijk等，2002；Thiel等，1991)，介导吸附病毒进入宿主细胞(Hulst等，1997)。Eros蛋白227个氨基酸残基中，存在9个潜在糖基化位点，糖基化程度最高，对病毒的毒力有重要作用(Rtimenapf,1993；Windisch等，1996)。Ems蛋白上面含有大量的抗原表位，能够诱导机体产生中和抗体。Kosmidou等证明毒株之间Eros蛋白具有较大的变异性(Kosmidou等，1995)。此外，Eros蛋白还有RNase活性和免疫抑制活性。1．2．2．8E1蛋白猪瘟病毒结构蛋白E1由195个氨基酸残基构成，编码基因为585个核苷酸，3个囊膜糖蛋白中N．连接糖基化位点最少，糖基化程度最低。该蛋白由蛋白水解酶，信号肽酶，糖基化酶共同作用裂解而成，常和E2蛋白结合后，以异源二聚体的形式嵌埋在病毒囊膜内，无法诱导产生中和抗体，但对稳固病毒粒子构型具有重要作用。E1蛋白氨基酸序列中有2段疏水序列(Leu548．Pr0579，Thr659．Gly689)，多聚蛋白在内质网腔内的转位过程中分别行使起始信号和终止信号肽功能。此外，E1还跟CSFV在猪体内毒力有关。猪瘟病毒E2囊膜糖蛋白囊膜糖蛋白E2是猪瘟病毒识别和吸附宿主细胞的结构蛋(了(Reimann等，2004)，是猪瘟病毒维持生命所必需的蛋白，如果基因突变导致猪瘟病毒E2部分或全部缺失，病毒将不能生存(VanGennip等，2004)，此外，E2蛋白与还是猪瘟病毒毒力决定基因(Risatti等，2005)。E2蛋白在猪瘟病毒的生命周期中发挥多重作用。12 山东农业大学硕士学位论文1．3．1猪瘟病毒E2基因结构与功能5’CGGCTAGCCTGCAAGGAAGArTACAGGTACGCACl、A1’CGTCAACCAATGAGAI'AGGGCTACTCGGGGCCGGAGGTCTCACTACCACCTGGGAAGApd’ACAGCCACGATTTGCAACTGAATGACGGGACCGTlAAGGCCArTTGCGTGGCAGGTTCC下兀AAAGTCACAGCACTTAATGTGGTCAGTAGGAGGTATTTGGCATCArTGCp江AAGGGGGCTTTACTCACTTCCGTGACArrCGAGCTCCTGTTCGACGGGACCAACCCATCAACCGAAGAAATGGGAGATGACTTCGGGTTCGGGCTGTGCCCGll’TGAI’ACGAGTCCTGTTGTCAAGGGAAAGl-～CAATACAACCTTGTTGAACGGTAGTGCTTTCTACCTTGTCTGCCCAALTAGGGTGGACGGGTGTL辄AGAGTGCACAGCAGTGAGCCCAACAACTCTGAGAACAGAAGTGGTAAAGACCTTCAGGAGAGAGAAGCCll’1’CCCACACAGAATGGATTGTGTGACCACCACAGTGGAAATGAAGATCTf盯TCl、ACTGTAAGTTGGGGGGCAACTGGACArGTGTGAAAGGTGAACCAGTGGTCTACACAGGGGGGCAAGTAAACAATGCAAp汀GGTGTGGCTTCGACTTCAACGAGCCTGACGGACTCCCACACTACCCCATAGGTAAGTGCA=rTTTGGCAAATGAGACAGGIrTACAGAATAGTAG声dTCAACGGACTGTI气ACAGAGArGGC(nT(n’AATCAGCGCAGAGGGGA(订CATGAGTGCT，rGATCGGCAACACAACTGTCAAGGTGCATGCATCAGATGAGAGACTG(论CCCTATGCCATGCAGACC’rAAAGAGArTGTCTCTAGTGCAGGACCT'GTAAGGAAAACTTCCTGTACAr，rCAACTACGCAAAAACTTTGAAGAACAAGTACl：ⅪGAGCCCAGGGACAGCTACTTCCAGCA久n钢jATGCTCAAGGGCGAGliATCAGTACTGGT，TTGACCTGGACGTGACAGACCGCCACTCAGAnACTTCGCAGAArlTGTTGTCTTGGTGGTGGTAGCACTGTTAGGAGGAAGArATGTCCTGTGGCTGAIAGTGACCTACATAGTTCl：f气ACAGAACAACTCGCCGCTGGT3’(2441-3559)E2全基因长度为1119个核苷酸，负责编码373个氨基酸fMoormannandWarmerdamandvanderMeerandSchaaperand等，1990)。132基因在猪瘟病毒全基因组中的位置，开始于第2441位核苷酸终止于第3559位核苷酸(参考CSFVAlfortl87株，GenBank登录号：X87939)，其中568个核苷酸在11个亚型中绝对保守的，突变随机发生于整条序列中551个核苷酸位点，几乎遍及每个密码子上，大约190左右的核苷酸突变为点突变，大部分突变不能引起氨基酸位点的替换，只有少数突变能够引起相应氨基酸位点发生特异性替换，某些抗原表位中的氨基酸发生替换可能导致该抗原表位发生变化，不同亚型的猪瘟病毒流行毒株氨基酸替代规律具有群问特点，另外，一些氨基酸替换能够引起E2蛋白N．糖基化位点变异甚至丢失，这种变异对猪瘟病毒能够产生重要的影响，E2基因在CSFV流行过程中较易出现变异，变异幅度在3．2％．25．0％13 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查之fnq(Lowings，1996；Risatti等，2007)。1．3．2猪瘟病毒E2蛋白结构与功能囊膜糖蛋白E2一级结构为373个氨基酸残基，起始于中间大阅读框(ORF)第690位氨基酸，终止于第1062位氨基酸，分子量为41500道尔顿。1—176aa为N端非保守区，在N端上游有一段信号肽序列，177．373aa为C端保守区，C端末尾不远处，有一个约18个氨基酸的疏水侧链，可形成跨膜蛋Et(transmembraneprotein，TMP)。N端非保守区包括A区(86．176aa)，B区(1-83aa)，C区(1．1lOaa)和D区(86．1lOaa)四个抗原结构域，A区又包含3个亚抗原结构域，A1La．2相连亚区(86．167aa)，A3亚区(86．123aa)。A1L久2(86．167aa)较为保守，A3、B、C、D具有可变性。其中A1LA2、B、C区域为抗原决定簇的主要集中区域，对诱导机体产生中和抗体发挥重要作用(VanRijn等，1994；Weiland等，1990；Wensvoort，1989)，见图2。整条序列上面含有3个保守的疏水区(CRI，109．155aa：CRII，306．330aa；CRIII，337．373aa)(Garry等，2003)。15个半胱氨酸(Cys)残基，N端非保守区有6个，C端保守区有9个，它们在E2蛋白氨基酸序列中的位置分别是4aa，48aa，103aa，129aa，139aa，167aa，180aa，188aa，204aa，207aa，225aa，241aa，256aa，277aa，294aa，在所有CSFV毒株的E2蛋白中数量和位置均很保守(MoormannandWarmerdamandvanderMeerHulst，1990)，N．端(1．176aa)6个Cys残基能够影响E2蛋白空间结构的正确折叠，对特异的抗原决定簇形成非常关键，Cys4与Cysl39形成的二硫键稳固抗原结构域B区和C区的构型具有重要作用(VanRijn等，1993；李红卫等，1997)。糖基化是蛋白质修饰中常见的类型，在蛋白质的一级结构中，天冬氨酸与丝氨酸或苏氨酸以Asn-X．Ser／Thr方式存在，X为任何一种氨基酸，低聚糖可与特异的天冬氨酸残基发生共价结合形成潜在的N．糖基化位点(Komfeld等，1985)，糖基化状况与病毒在猪体内的毒力有关。猪瘟病毒E2含有5．7个潜在的N．糖基化位点，它们的位置分别为88．90aa，116．118aa，121．123aa，185．187aa，229．23laa，260—262aa，297—300aa(Weiland，1990；Wensvoort，1989)，118位(116-118aa)，123位(121-123aa)，187位(185．187aa)，231位(229．231aa)四个N．糖基化位点所有病毒亚型所共有，90位糖基化位点为1．1亚型毒株所特有，一些强毒株，Shimen株，Alfort187株以及Brescia株，第299位氨基酸发生了Th卜，舢a替换，因此，不能形成潜在的299位(297-300aa)N．糖基化位点，推测该糖基化位点与病毒的毒力有关。陈宁等研究中Ⅸ一05株229位氨基 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查到CSFV感染的细胞膜上，发挥介导病毒的感染，与病毒粒子侵入细胞有关。E2蛋白还是猪瘟病毒毒力的决定子，Risatti等(Risatti，2005)应用经典强毒株Brescia株和毒力致弱的疫苗株CS株，构建了大量的嵌合体，发现只有被CS株E2基因替代的Brescia株嵌合体，体内感染实验动物后，只表现出亚临床表现，且病毒粒子在扁桃体的复制率降低，排毒量减少，病毒的扩散也受到很大的限制，呈一过性毒血症。另一项研究证实E2糖蛋白C．末端区域突变可使CSFV的毒力减弱。蛋白质的功能受到其空间结构的影响，但是蛋白质的空间结构和功能是由蛋白质一级结构即氨基酸序列决定的，对E2氨基酸序列进行分析对研究E2蛋白质空间结构的形成和作用机理具有重要作用，从而为彻底揭示CSFV遗传变异和进化机制奠定基础。1．4猪瘟病毒发病机理1．4．1猪瘟病毒免疫抑制机理猪瘟病毒主要经过消化道、呼吸道、皮肤等感染，CSFV的免疫器官嗜性，使感染猪体的免疫器官及免疫细胞首先成为CSFV侵害的首要靶向位置，这些位置的病毒早感染早起含量已经很高，CSFV一般可在免疫器官中最早被检测出来。在病毒感染早期，CSFV的感染路径可概括为，首先在舌、扁桃体、皮肤的基底层细胞单个或团状存在，然后侵入到舌的中间层，扁桃体的网状内皮细胞，皮肤的生发层等，另外还有舌涎腺，脑中的神经元及胶质细胞，血管窦状隙，枯否氏细胞，外周血单核白细胞等处迅速大量增殖，最后，遍布全身各个器官，脑、肺、肝、脾、胰、肾、食管、胃、肠等器官，及甲状腺、胸腺、肾上腺等腺体中均有CSFV粒子的分布(Pan等，1993)。CSFV的淋巴组织嗜性，使病毒在感染初期，进入扁桃体及周围淋巴组织B淋巴滤泡中大量增殖，破坏淋巴滤泡，造成感染猪免疫系统损伤(Moening，1990；Susa,1992)，此外，CSFV还能够损害淋巴细胞生发中心，阻止淋巴细胞的发育成熟，一般感染猪骨髓造血细胞坏死和凋亡，骨髓淋巴细胞凋亡，使骨髓的免疫功能遭到严重破坏，外周血T淋巴细胞减少，白细胞减少(Shimizu等，1995)。I型干扰素具有抗病毒活性，CSFV能够抑制I型干扰素的产生。CSFV通过这些方式抑制瘟猪的体液免疫和细胞免疫，达到侵染的目的。此外，树突状细胞位于皮肤和黏膜的表层，该细胞不仅能够识别抗原并将其递呈至淋巴细胞，诱导T淋巴细胞分化并产生免疫反应，而且直接激活B淋巴细胞，使机体产生免疫记忆。Carrasco等(Carrasco等，2004)用CSFV强毒株Brescia株体外感染树突状细胞发现，CSFV16 山东农业大学硕士学位论文不能诱导树突状细胞产生I型干扰素，且无任何表型，功能的改变，故推测CSFV具有产生免疫无应答，从而逃避机体免疫作用。1．4．2猪瘟病毒与宿主细胞CSFV进行体外细胞培养时，不能够使PK．15和EC细胞发生细胞病变，CSFV非结构蛋白NS2、NS3具有调控细胞病变的功能，NS2能够抑制病毒RNA的过量复制，防止病毒粒子过度在细胞内的堆积导致细胞死亡，而NS3的过量表达则会引起细胞发生病变效应(MeyersandThieland等，1996；Moser等，1999)。CSFV在细胞中病毒粒子的滴度比较低，且对细胞周期中各阶段无明显影响，使得病毒能够持续存在于细胞内，可能跟CSFV某种机制有关。有研究发现非洲猪瘟病毒含有抑制凋亡的基因A179L，其编码的蛋白在体外能够抑制Vero细胞的凋亡，可能跟CSFV持续性感染有关。CSFV感染能够引起出血机制除了能够促使纤维蛋白溶解，造成病猪凝血不良，另外，还可能与血管内皮细胞蛋白相互作用，使血管上皮细胞通透性发生变化有关。1．5猪瘟病毒检测技术根据流行病学特点、疾病表现和特征性病理变化，经验丰富的饲养者和兽医可对典型猪瘟作出初步诊断。但要及时有效诊断非典型猪瘟，尤其伴有混合感染的猪瘟，仅凭临床症状难以作出诊断，因此实验室诊断是必不可少的。1．5．1病毒分离病毒分离是最经典可靠且最特异的检测方法。猪瘟病毒的自然宿主为家猪和野猪，猪感染猪瘟病毒后经常引起发病，甚至死亡，其它哺乳动物细胞对猪瘟病毒也具有易感性，一般不能引起发病，但是有婴儿感染猪瘟病毒死亡的案例。猪瘟病毒一般不能够使细胞发生病变(CPE)，但是有些毒株能够使某些细胞发生CPE。猪瘟病毒流行毒株的分离鉴定最常用的细胞系有SK．6、PK．15，而兔化弱毒毒株一般不能再其它细胞上生长，其分离鉴定只能用犊牛睾丸原代细胞。将病猪脾脏、肾脏、扁桃体和淋巴结等组织，加入10倍双抗MEM进行研磨，12000r／min离心10min，0．22Inn滤器过滤后接种PK．15、SK-6和EC(猪脐静脉血管内皮细胞)等细胞进行病毒分离。再将分离出的病毒接种到健康猪体内，若呈现典型猪瘟临床症状即可确诊。病毒分离技术的优点在于特异性强， 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查能客观反映病毒的存在，缺点在于病毒阳性检出率低、耗时长和成本高，通常仅适用于实验室诊断，临床推广难度较大。实验室进行病毒分离是因为只有分离出病毒才能对CSFV流行毒株其它生物学特性进行深入研究。对不同年代不同地方的CSFV毒株进行分离并保存，建立世界范围内背景清晰的病毒库，对于疫苗的开发，探索流行毒株的遗传变异和抗原分析，全球范围内对猪瘟进行监测，从而彻底根除猪瘟具有十分重要的意义。1．5．2动物试验扁桃体是病毒分离的首选器官，若采集不到该组织，脾脏、肾脏和淋巴结也可。将采集到的病料进行研磨后加入MEM制成组织匀浆，除菌后接种易感猪并观察发病情况，然后进行病毒分离。中国兽医药品监察所研制了检测猪瘟的兔体免疫交互试验体系，具体方法为：用健康家兔取代易感猪接种病料乳剂，7d后给家兔注射兔化猪瘟弱毒，24h后每间隔6h测量1次体温，连续3d。根据体温变化判断家兔是否感染猪瘟病毒：若体温反应呈定型热，判断家兔体内无猪瘟病毒存在(王明俊等，1997)I若体温反应正常，表明体内存在猪瘟病毒。动物试验法特异性强，但也有自身的缺点就是耗时长、成本高且无法区分毒株，常用CSFV易感的动物对毒力减弱病毒株进行体内复壮。1．5．3血清学检测技术血清中和试验：该方法常用于检测猪体内抗体水平。猪群在大量接种猪瘟兔化弱毒疫苗后，猪瘟抗体水平普遍较高，为确定抗体滴度的变化，常采集免疫接种前后14d以上双份血清进行检测。目前应用最广泛的是免疫荧光中和试验和PAV株中和试验(杨克礼等，2007)。邵振华等(邵振华等，1995)分别采集65份70日龄、34份5．6月龄、44份7月龄的猪瘟非免疫猪血清，应用免疫荧光中和试验检测猪瘟母源抗体，结果表明：70日龄仔猪猪瘟母源抗体阳性检出率为52．3％；5-6月龄和7月龄仔猪猪瘟母源抗体检测结果呈阴性。猪瘟兔体免疫交互试验检测结果为：70日龄阳性检出率为47．5％，5—6月龄阳性检出率为42．5％。由此可见，免疫荧光中和试验检测效果更佳。血清中和试验方便、省时省力，美中不足之处在于无法对猪瘟抗体水平滴度进行精确检测。血凝试验：包括直接血凝试验和间接血凝试验，其基本原理都是利用已知抗原检测血清中的抗体。如李晓华等应用直接血凝试验，即通过吸附于红细胞表面的致敏性抗原与相应抗体结合是否出现肉眼可见的凝集现象检测猪瘟抗体的存在。李树春等(李树 山东农业大学硕士学位论文春，2000)应用间接血凝试验，即用戊二醛鞣酸处理健康绵羊红细胞，后用浓缩纯化猪瘟兔化毒株细胞培养物将其致敏，再用制成的冻干猪瘟间接血凝诊断液检测血清中的猪瘟抗体效价。猪瘟血凝试验优势在于操作简单、特异性强、重复性好等，缺点是耗时长和成本高。酶联免疫吸附试验(ELISA)：是一种将特异性反应系统、间接放大系统和显示系统结合于一体的先进检测技术，其基本原理是将固相载体用特异性抗体进行包被，待测抗原通过抗原决定簇与包被的抗体和酶标抗体发生特异性结合。ELISA可检测出感染猪瘟病毒10．15天后出现的抗体，这与产生中和抗体的时间接近。血清终端滴度决定中和抗体水平，中和抗体水平与50％抑制率的最高稀释度的血清呈负相关。为排除瘟病毒之间抗体交叉反应的影响，比较猪瘟病毒中和抗体水平与牛病毒性腹泻病毒参考毒株的中和抗体水平，根据两抗体终端滴度差距是否在4倍或4倍以上判断是否存在猪瘟病毒感染(Manual，1992)。该法灵敏度高、可一次性进行大批量检测，但特异性和相关性差。免疫荧光技术(FA)：又称荧光抗体技术，是用荧光标记抗原或抗体，以抗原与抗体特异性结合为基础，通过荧光显微镜下观察对细胞和组织内的抗原和抗体进行准确定位。Robertson等(Robertson等，1965)首次运用荧光抗体检测猪瘟病料和组织培养物，结果在病死猪器官的冷冻组织切片中发现猪瘟病毒抗原。免疫荧光检测技术优势在于能够观察到病毒的分布，增殖动态过程，具有相当高的准确性，劣势在于灵敏度稍差、操作过程比较繁琐，实验成本很高、结果判定受人为因素很大，实验过程非特异性染色往往难以辨别。1．5．4分子生物学诊断技术聚合酶链式反应(PCR)：以PCR为基础用于检测猪瘟病毒的方法有很多种。RT-PCR是将病毒RNA进行反转录得eDNA，再以eDNA为模板对病毒核酸进行扩增从而检测病毒存在。Sand．Vik等利用此法检测猪瘟病毒行，发现该法特异性强、阳性检出率高且生物安全性好，但成本较高(MeGoldrick等，1998；Sandvik等，1997)。RT-nPCR(RT-nestedPCR)是以第一对引物扩增产物做为模板进行二次扩增的方法，根据引物可将其分为半套式RT-PCR和全套式RT-PCR。RT-nPCR应用两对引物大大提高了检测的特异性和灵敏度，解决了组织中病毒量低的问题。Choi等(Choi等，2003)应用半套式RT-PCR检测人工攻毒的公猪精液，结果在精液中发现猪瘟病毒的核酸，而病毒分离等其他检测方法通常在精液中无法检测到病毒；Katz等(Katz等，1993)开发了一种可以19 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查区分猪瘟病毒(CSFV)与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的nPCR；Paton等(Paton，2000)针对RT-PCR和RT-nPCR敏感度和特异性进行了比较，结果表明RT-nPCR的敏感性是RT-PCR的10．100倍。实时荧光定量PCR(real-timequantitativePCR)是通过PCR扩增反应过程中荧光信号的变化，绘制Ct值和标准曲线，进而定量分析模板浓度的一种方法，解决了普通PCR不能对PCR扩增反应实时检测的问题。Hoffmann(Hoffmann等，2005)建立一种复合实时荧光定量RT-PCR方法(包含内参对照)，该方法检测猪瘟病毒RNA的最低拷贝数可达8拷贝／ul；应用荧光定量RT-PCR方法，Ophuis等在攻毒后第一天就在扁桃体内检测出病毒，表明该法可用于猪瘟病毒的早期诊断(Ophuis等，2006)；后陆续出现该方法用于区分野毒感染或是接种疫苗的相关报道(Cho等，2006；Gaede等，2005；Uttenthal等，2003)。该技术优势在于特异性强、灵敏度高、能避免血清学交叉反应且可实时定量检测等，它将会在诊断动物疫病中具有更广阔的发展空间。核酸探针法：该方法以分子标记为基础，病毒RNA为模板设计探针，在合成cDNA后进行Southem．blotting，由于核酸探针具有特异性，因此针对不同cDNA有相应特异性条带产生。Cruliere等针对猪瘟病毒基因组RNA构建cDNA，并将其与牛病毒性腹泻病毒序列进行比对分析，设计合成6条探针，根据它们在病毒基因组的位置，结合产生的特异条带将猪瘟病毒，牛病毒性腹泻病毒以及绵羊边界病病毒加以区分。核酸探针技术具有准确可靠、高特异性等优点，适用分离和与鉴定不同毒株。基因芯片(genechips)：也称寡核苷酸微阵列，它是将成千上万的寡核苷酸高密度且有序地固定于芯片上，再用标记的样品与其进行杂交，进而实现对千万个基因的同步检测。基因芯片根据探针种类可划分cDNA芯片、寡核苷酸芯片和基因组芯片，主要用于DNA测序、基因表达水平的检测、基因突变以及基因多态性的检测、疾病诊断等多方面。20 山东农业大学硕士学位论文材料与方法2．1材料2．1．1疑似CSF病料本研究所用疑似猪瘟样本，由佛山科学技术学院吕宗吉副教授提供，415份样本来自广东省广州市(50份)、东莞市(18份)、佛山市(199份)、惠州市(10份)、江门市(20份)、清远市(28份)、韶关市(10份)、深圳市(27份)、阳江市(8份)、肇庆市(35份)、中山市(10份)11个城市所辖区、县的猪瘟发病猪场或散养户，于2011年7月至9月采集，样本为疑似猪瘟猪肾脏组织，分别来自415个猪场。2．1．2试剂与耗材TrizolReagentRNA提取试剂盒，购自Invitrogen公司；MN试剂盒购自MACHEI也Y．-NAGEL公司；QIAGEN试剂盒购自QIAGEN公司；5xM．MLVbuffer，dNTPMix(2．5mMeach)，随机引物(10mMeach)，RNase抑制剂(40u／frO，M-MLV(200U／lxl)等PCR扩增试剂购自TaKaRa公司；DEPC．H20购自上海生工；D2000Marker购自天根生物技术有限公司；DNA回收纯化试剂盒及其它耗材购自Promega公司；小牛血清和马血清均购自Gibco公司；MEM、M199和FITC标记的兔抗猪IgG，伊文斯兰均为Sigma公司产品，其它试剂均为分析纯；Eppendorf核酸提取工作站所用耗材购自MACHEI也Y．-NAGEL公司，96孔细胞培养板，25T细胞培养瓶均为国外进口，10mL玻璃细胞培养瓶，直径为0．22pro滤器。2．1．3细胞、毒株和抗体猪。肾细胞系(PK一15)；永生化猪脐静脉血管内皮细胞系(EC)第F87代(张思春等，2012)；猪瘟石门血毒(shimen)猪抗CSFV阳性血清(一抗)，FITC标记的兔抗猪IgG(二抗)。2．1．4主要的仪器设备与器材Eppendorf核酸提取工作站(MAC髓REY-NAGEL，德国)；TissueLyserII组织匀浆制备仪(QIAGEN，德国)；台式高速离心机(Eppendorf,德国)；DYY-I]_[--8B稳压稳流型电泳仪(北京市六一仪器厂)；凝胶成像系统(UVITEC，美国)；PTC200PCR仪(BIO．RAD，美国)；二氧化碳培养箱(Thermo，美国)；倒置荧光显微镜：Axioskop40(ZEISS，德国)；生物安全柜：ClassII(Thermo，美国)；电子天平：BPl21S(Sartorius，德国)；超低温冰箱ELT-13V-85V28(HARRIS，美国)。21 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查2．1．5实验室常用各种培养基和溶液的配制(1)MEM与M199细胞生长液：10％马血清(Gibco，荷兰)；1％双抗(青链霉素)；1％谷氨酰胺，现配现用。(2)MEM与M199细胞维持液：2％马血清(Gibco，荷兰)；1％双抗(青链霉素)；1％谷氨酰胺，现配现用。(3)10xPBS(pH7．4)贮存液：称取Na2HP04·12H2058．0g，NaCl160．0g，KH2P044．0g，KCl4．0g，先溶于1500mL蒸馏水，充分溶解后，定容至2L，调PH值至7．4，高压灭菌后，室温保存。(4)1×PBS(pH7．4)工作液：称取Na2HP04·12H202．9g，NaCl8．0g，KH2P040．2g、KCl0．2g，溶于800mL蒸馏水，充分溶解后，定容至lL，调PH值至7．4，高压灭菌后使用；PBST为含吐温0．05％的1×PBS。(5)丙酮固定液：将分析纯丙酮利用蒸馏水配制成70％．80％丙酮固定液，．20。C保存备用。(6)间接免疫荧光一抗稀释液：用含10％dx牛血清(Gibco，荷兰)1×PBS对猪抗CSFV高免血清(5#血清)做100倍稀释。(注：猪抗CSFV血清为军事兽医研究所制备)。(7)间接免疫荧光二抗稀释液：用含10％dx牛血清(Gibco，荷兰)1×PBS将FITC标记的兔抗猪IgG稀释100倍，按体积比(1／8000)加入伊文斯兰。(8)荧光封固剂：含60％．80％甘油的1×PBS缓冲液。2．1．6引物设计及合成2．1．6．1检测CSFV所用引物猪瘟病毒检测使用欧盟猪瘟诊断手册推荐的巢式PCR(testedRT-PCR)方法，采用2对PCR引物特异性扩增CSFV基因组中E2基因部分片段中特定区段，通过内套PCR、外套PCR进行二次扩增，提高了检测的灵敏度和特异性，本方法一直作为本实验室猪瘟检测常规手段。引物均由Invi仃ogen(上海)贸易有限公司合成。引物序列信息及在Alfortl87株基因组中位置：‘～．‘，；：+外套：(671bp)nCSFV-wFP：5’AGRCCAGACTGGCCNTAYGA3’(2228—2250)nCSFV-wRP：5’TTYACCACTTCTGTTCTCA3’(2898—2880)内套：(271bp)nCSFV-nFP：5’TCRWCAACCAAYGAGATAGGG3’f2477．2497) 山东农业大学硕士学位论文nCSFV-nRP：5’CACAGYCCRAAYCCRAAGTCATC3’(2748-2726)2．1．6．2猪蓝耳病病毒检测引物猪蓝耳病病毒(PI汛SV)所用引物为哈兽研设计用于扩增NSP2基因，所对应的退火温度为57．0*C，经典毒株为293bp为低致病，变异株产物片段(缺失后)大小为203bp为高致病株。PRRSV引物序列信息：PRRSV237(18)：5’CGGAAGAAACTGTCGGTG3’PRRSV422(18)：5’CGCAGACAAATCCAGAGG3’2．1．6．3猪圆环病毒2型检测引物PCV-2检测外套引物(481bp)PCV-2．WF：5’CGGArf盯TGTAGTCCTGGTCG3’PCV-2．、ⅣR：5’ACTGTCAAGGCl’ACCACAGTCA3’PCV-2检测内套引物(225bp)PCV-2-NF：5’GATTGTATGGCGGGAGGAGT3’PCV-2-NR：5’ArTGACGACTTTGTTCCCCC3’2．1．6．4猪伪狂犬病毒检测引物猪伪狂犬病毒(PRV)检测的是gp50基因，217bp片段，退火温度为65"C。PRV检测引物序列信息：PRV(gp50)FP：5’-CACGGAGGACGAGCTGGGGCT-3’(434-455)PRV(gp50)RP：5’-GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT-3’(650—629)2．1．6．5牛病毒性腹泻病毒(BVDV)检测引物BVDV检测外套引物(280．284bp)P103F．"5’TAGCCATGCCCTTAGTAGGACT3’(103．124NADL)P365R：5’TGTGCCATGTACAGCAGAGATT3’(386．365NADL)BVDV检测内套引物(191bp)B145F：5’AACAGTGGTGAGTTCGTTGGAT3’(145．166NADL)·，、B314R：5’CACCCTATCAGGCTGTf岍CGT3’(335．314NADL)2．1．7生物信息学分析软件引物设计软件：Primer6．0，DNASTAR；序列同源性分析软件：DNASTAR软件包MegAlign软件；系统进化树分析软件：MEGA5．05软件，分支年代分析软件BEASTv1．5。4 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查软件包。2．2方法2．2．1广东省疑似猪瘟样本的检测2．2．1．1广东省疑似猪瘟样本猪瘟病毒的检测2．2．1．1．1疑似猪瘟样本的制备(1)取猪肾组织0．19(大约豆粒般大小)，于2mL收集管中，然后用剪刀在收集管中尽量剪碎，至成糊状。(2)用玻璃吸管吸取1mLMEM，最后放入钢珠(直径5mm钢珠1个，直径3mm钢珠2个)上下颠倒混匀。(3)将2mL收集管对称放置．20。C预冷的两个适配器中，然后将适配器固定在组织研磨仪上，打开电源，26HZ，震荡6min。(4)待组织匀浆后，立即将组织研磨液从收集管中转移到1．5mL离心管中，并做好标记。(5)将1．5mL离心管于4。C离心机，8000r／min，离心5min，除去未研碎的组织。(6)吸取100gl上清至96孔样品板中。注意事项：两个适配器的样品应对称放置，频率不宜太大，否则容易将收集管震破。2．2．1．1．2Eppendorf核酸提取工作站样本总RNA提取2．2．1．1．2．1试剂槽准备在用Eppendorf核酸提取工作站提取核酸前，将试剂按相应的试剂槽内相应位置，加入核酸提取所用的试剂，每次提取样本数量为96个，对应试剂量如表1所示。2．2．1．1．2．2工作站准备表1试剂槽中试剂量Table．1Amountofregentsinthereagentreservoir 山东农业大学硕士学位论文(1)拿开布罩，依次打开主机电源，工作站电源。(2)10009l枪头(一盒半)，样品槽，试剂槽，吸附板，垃圾袋，废液缸按顺序放好，RNA收集板置于一20℃备用。(3)RNA提取所用程序：MN．samples．96．WS．2．2．1．1．2．3MN试剂盒提取样本总RNA提取(1)吸取400lxlRAVI(裂解液，主要成分是胍盐)，加入样品板96孔，56。C，1200r／min震荡10min。(2)然后加入400p．1无水乙醇(-20。C保存)，充分混合，用于溶解有机物和RNA，以免堵塞吸附柱。(3)将裂解后的样品与乙醇充分混合溶解，然后转移至吸附柱，600mbar，真空抽滤5min。(4)向吸附柱内加入500rtlRAW，600mbar，真空抽滤5min。(5)洗涤：吸取700山RAV3于吸附柱中，600mbar，真空抽滤5min，重复洗涤一次。(6)洗脱：每孔中加入100山洗脱液RE(70"C预热)于吸附柱中，600mbar，真空抽滤10min，即可得到总RNA。2．2．1．1．3CSFV总RNA反转录为eDNA反转录体系209l：5xM—MLVbuffer4．01xl，dNTPMix(2．5mmol／Leach)1．51xl，随机引物(10mmol／Leach)1．5I．tl，RNase抑制剂(40U／lxl)0．5山，M-MLV(200U／lxl)1．01xl，DEPC．H201．59l，RNA模板10．01xl，反转录温控程序：42。C1h，95。C5min。2．2．1．1．4内外套体系及扩增条件取2lxlRT产物，内、外套PCR扩增体系均为501xl：ddH2036．71al，10xEXTaqbuffer(M92+Plus)5．0“l，dNTPs(2．5mmol／Leach)4．0pl，Ex-Taq(5u／I．t1)0．3“l，上下游引物(10I_tmol／L)各1．0pl，PCR温控程序：95。C5mill-÷(95。C60s，55。C1min，72℃1min)35个循环-÷72℃延伸7min。2．2．1．1．5内套PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定．扩增结束后取5lxlPCR产物在1．5％琼脂糖凝胶中进行电泳(120V，25min)，观察结果。2．2．1．2PRRSV、PCV-2、PRV核酸检测2．2．1．2．157份猪瘟病毒阳性样本制备剪取猪瘟病毒阳性样本，即肾脏组织块100mg，置于预冷的无菌的玻璃研磨器中， 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查加入lmL含10倍双抗的MEM进行研磨，研磨过程应避免样本之间交叉污染，将研磨好的组织匀浆置1．5mL离心管中，一80。C保存备用。2．2．1．2．257份猪瘟病毒阳性样本核酸提取取肾脏组织为对象，用双无MEM制成10％组织悬液，分别利用TrizolReagentRNA提取试剂盒提取样本RNA，用QIAGEN试剂盒提取样本DNA。2．2．1．2．2．1Trizol法提取样本RNA(1)取上述制备组织匀浆2009l，加入lmLTrizol后，室温放置5min，使其充分裂解。12000r／min离心15min，吸取上清，弃去沉淀。(2)加入2009l氯仿，振荡混匀后，室温放置15min。(3)4。C12000r／min离心15min。(4)吸取上清液，转移至另一离心管中，吸取过程中切勿吸取中间界面。(5)加入5009l异丙醇混匀，室温放置10min。(6)4*C12000r／min，离心10min，弃上清，RNA沉于管底。(7)加入lmL75％的乙醇，上下颠倒离心管，悬浮沉淀。(8)4℃12000r／min，离心5min，尽量弃上清。(9)室温晾干5．10min，用509l无RNA酶H20，溶解RNA。(10)按2．2．1．1．3中方法将RNA翻转录成eDNA。2．2．1．2．2．2QIAGEN试剂盒提取样本DNA。(1)80此组织研磨液，加入1009lBufferATL。(2)加入201xl蛋白酶K，震荡混匀，56。C孵育知道组织完全裂解(通常1．3h，每小时震荡2．3次)。(3)瞬离。(4)加入2001xlBufferAL震荡15s，70℃，孵育10min，瞬离。(5)加入200“1酒精(96％．100％)，震荡混匀15s，混匀后瞬离(可能出现白色沉淀，要一并转移至柱子)。(6)小心把混合物(包含沉淀)转移至Qiampminispineolum(含2mL收集管)柱子，关盖离心60009／min，然后把卒子转移至新的2mL收集管，丢掉以前那个，装有滤液的收集管(这一步速度可增大，保证所有的滤液都通过滤膜)。(7)小心打开柱子盖，加入5001xlBufferAWl，关盖离心，60009／min换新的收集管，丢掉以前那个。26 山东农业大学硕士学位论文(8)加入500}tlBufferAW2200009或14000r／min，3min。(9)建议换个新收集管，全速离心lmin。(10)把柱子放入1．5mL离心管，加入100．200山BufferAE或蒸馏水室温lmin，离心60009或8000r／min1min。2．2．1．2．3反转录将Trizol法提取样本总RNA，按照下面体系反转录成eDNA：5xM．MLVbuffer4．0山，dNTPMix(2．5mM)1．51xl，Primer6(10mM)1．5肛l，RRI(40U／lxl)O．51xl，M．MLV(200U／I上I)1．0p．1，DEPC-H201．5I．tl，RNA模板10．01xl，总体积为201．d。42*(21h，95℃5min。2．2．1．2．4猪瘟病毒(CSFV)与PRRSV、PCV-2和PRV混合感染检测以上述方法提取的核酸作为模板，对四种病毒病进行检测均按照下面体系进行PCR扩增：10xEXTaqBuffer(M92+Plus)5．0pl，引物1(10pmol／1．t1)和引物2(10pmol／}t1)各1．0“l，dNTPs(2．5mmol／L)4．0“l，Ex-Taq(5U／I-t1)O．3pl，用ddH20补够501al体系。猪瘟病毒(CSFV)是RNA病毒，取2．2．1．2．3中反转录cDNA为模板，按上述反应体系检测猪瘟病毒核酸。检测猪瘟病毒采用欧盟猪瘟诊断手册推荐使用的巢式PCR检测方法，温控程序95℃5min，(95℃60s，55。C1min，72"(21min)35个循环，72℃延伸7min。猪蓝耳病病毒(PRRSV)同猪瘟病毒一样也属于RNA病毒，模板同检测猪瘟病毒所用模板，检测所用引物为哈兽研设计用于扩增NSP2，所对应的退火温度为57．0℃，经典毒株为293bp为低致病，变异株产物片段(缺失后)大小为203bp为高致病株，温控反应程序如下：95℃3痂n_(95℃45s，57℃1min，72℃lmin)35个循环一72℃延伸5min。猪圆环病毒2型(PCV-2)为DNA病毒，直接取2．2．1．2．2．2中提DNA作为模板，应用2．1．6．3中两对引物对猪圆环病毒2型(PCV-2)核酸进行检测，内外套反应程序：95℃5min一(95℃45s，55℃45s，72℃45s)35个循环_÷72℃延伸7min。猪伪狂犬病毒(PRV)属于DNA病毒，扩增其gp50基因，217bp片段退火温度为65℃，所用模板同检测猪圆环病毒2型所用模板，PCR扩增温控温度反应程序如下：95℃3nliIl-÷(95℃45s，65℃1min，72℃程序1min)35个循环_72℃延伸5min。2．2．1．2．5核酸电泳鉴定将检测猪瘟，蓝耳病，伪狂犬病，圆环病毒病核酸PCR产物进行核酸电泳检测，1．5％琼脂糖凝胶，120V，27min，UVI凝胶成像系统进行鉴定。 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查2．2．2猪瘟病毒流行毒株的分离与培养2．2．2．1猪瘟阳性样本的制备剪取猪瘟病毒阳性肾组织样本大约100mg于高压灭菌处理过的玻璃研磨器内，加lmL无血清无双MEM充分研磨，将组织匀浆转移至1．5mL离心管，4。C12000r／min离心10min，用0．22gm滤器过滤除菌，为避免反复冻融将过滤后上清20091分装，．80。C保存，待分离病毒用。样本的制备过程注意低温操作，研磨过程中避免交叉污染。2．2．2．2细胞的培养2．2．2．2．1PK-15细胞选取生长状态良好的PK．15细胞，用含马血清10％MEM细胞培养生长液，进行细胞传代，37*(2，5％C02温箱培养，24h后及时换用含马血清2％MEM细胞培养维持液，继续培养48h后传代。用胰酶将PK．15细胞从玻璃细胞培养瓶上消化下来后，加入细胞培养生长液，用弯头吸管反复吹匀后，按照1：5的比例传至10mL细胞培养瓶中，培养12h后用于接种CSFV阳性样本研磨液上清。PK．15细胞传代方法(1)PK．15细胞用培养维持液培养48h后，弃去培养液至废液缸中。(2)加入1mL胰蛋白酶，来回晃动培养瓶数次，将胰蛋白酶弃去。(3)再加入1mL胰蛋白酶至培养瓶中，置37℃温箱消化5"--'8min，至细胞刚好脱落为最好，过度消化使细胞呈团块状不容易吹开，且容易损伤细胞。(4)加入9mL细胞生长液，将细胞吹打均匀使细胞分散为单个细胞。(5)将吹打均匀的细胞按l：5传代至玻璃细胞培养瓶中，置37。C，5％C02恒温箱中培养，用于病毒分离的细胞，最好24h内使用。2．2．2．2．2猪脐静脉血管内皮细胞(EC)猪脐静脉血管内皮细胞(EC)在玻璃瓶中生长状态不是很好，用于病毒分离一般采用一次性塑料培养瓶，本实验所用为外国进口25T细胞培养瓶，EC细胞生长液为含马血清10％M199，细胞维持液为含马血清5％M199。EC细胞生长较快，贴壁后应立即进行传代，否则会有大量细胞脱落，具体传代方法如下：(1)待EC细胞刚好铺满，弃细胞维持液，至废液缸中，加入lmL胰蛋白酶，来回晃动培养瓶数次，洗去残余的培养液。(2)将胰酶弃去，再加入lmL胰酶，置室温消化1min，至细胞刚好分散成单个细胞，但没有变圆时为最好。 山东农业大学硕士学位论文(3)弃去胰酶，加入5mL细胞生长液，轻轻吹打使细胞分散开来。(4)按l：4的比例进行传代，24h内用于CSFV分离。2．2．2．3CSFV流行毒株的分离与培养2．2．2．3．1接毒的方法与步骤(1)待单层细胞铺至60％一80％，弃去培养液，加入lmL无血清无双抗MEM洗涤2．3去除剩余的培养液。(2)取200}tl过滤后的研磨液上清，用无血清无双抗MEM将稀释至1mL，加入细胞培养瓶中，37。C，5％C02恒温箱感作1．5h，中间将细胞培养瓶摇晃1．2，使单层细胞充分吸附病毒粒子。(3)弃去感作液，加入1．2无血清无双抗MEM，洗涤2．3次，除去杂质，以免影响细胞正常生长。(4)最后加入细胞维持液，置37。C，5％C02恒温箱中，继续培养培养48．72h。2．2．2．3．2猪瘟病毒流行毒株的细胞带毒传代细胞接毒后，每天于显微镜下观察细胞的生长状况，看有没有发生细胞病变，并做好记录。至细胞长满后，按细胞培养的方法进行传代，对不同编号毒株的每代细胞培养液上清收集至细胞冻存管中，做好标记(F1．F5)，．80℃保存。如此，分别将每株毒株带毒传代至F5代。2．2．2．4CSFV流行毒株间接免疫荧光鉴定在进行带毒传代时，平行将一部分细胞传至96孔细胞培养板，每株毒株做4孔重复，置37。C，5％C02温箱中培养48．72h，用于猪瘟病毒的间接免疫荧光(IFA)鉴定。2．2．2．4．1感染CSFV细胞的固定与染色(1)待96孔板中细胞培养至48．72h，培养板中培养基轻轻倒掉。(2)用1xPBS缓冲液轻轻洗涤2—3次，5min200Itl／孔，加入80％冷丙酮，501xl／孔，于．20℃固定30．60min。(3)倒掉丙酮，用1xPBST(O．05％Tween20的PBS)洗3次．5min／次。(4)加入稀释后的一抗，50pl／孔，37。C温箱中感作1h，再用PBST洗5次，5min／次。(5)加入二抗，，50州孔，37*(2感作1h，用PBST洗5．7次，洗掉没有结合的二抗，5min／次。(6)加入封固液(80％甘油的PBS缓冲液)，50p,1／孔，将96孔板倒置在能激发488nm(FITC)的正置荧光显微镜：Axioskop40(ZEISS，德国)下使用10x物镜进行观察。 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查2．2．2．4．2间接免疫荧光(IFA)鉴定感染CSFV的细胞，在其胞质可见到明亮的“苹果绿色”的荧光，而正常细胞则为红色，正常的细胞设为阴性对照，感染石门毒的细胞设为阳性对照。IFA鉴定阳性，即判定为分离出CSFV流行毒株。2．2．2．5牛病毒性粘膜腹泻病病毒PCR鉴定猪瘟病毒(CSFV)与牛病毒性粘膜腹泻病病毒(BVDV)都属黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(伊nusPestivirus)成员，基因组结构相似，血清学检测存在交叉反应，猪能够感染BVDV并表现出猪瘟亚临床症状，病毒分离通过间接免疫荧光法(IFA)无法将两种区分开来。将细胞毒猪瘟病毒IFA鉴定呈阳性细胞培养上清，提取RNA，反转录后再检测BVDV核酸，若BVDV呈阴性则说明分离株为猪瘟病毒流行毒株。2．2．2．6猪瘟病毒在PK．15细胞中感染动态过程2．2．2．6．1猪瘟病毒感染PK．15细胞感染率较低时CSFV在细胞中增殖情况在CSFV感染细胞阳性率比较低时(<40％)，将同代次带毒细胞，传至3个96孔板A1、B1、C1，37℃5％C02恒温箱中，分别培养24h、48h、72h后，用80％冷丙酮固定，同时做间接免疫荧光(IFA)观察细胞感染情况变化。2．2．2．6．2猪瘟病毒感染PK．15细胞感染率较高时CSFV在细胞中增殖情况在CSFV感染细胞阳性率比较高时(>80％)，将同代次带毒细胞，传至3个96孔板A2、B2、C2，37。C5％C02恒温箱中，分别培养24h、48h、72h后，用80％冷丙酮固定，同时做间接免疫荧光(IFA)观察细胞感染情况变化。2．2．2．6．3CSFV流行毒株带毒传代感染情况变化猪瘟病毒流行毒株接种在PK-15细胞进行带毒传代培养，F2代至F5代，将每一代细胞分别传至4个96孔板A3、B3、C3、D3，37。C5％C02恒温箱中，均培养72h后，80％冷丙酮固定，不同代次细胞板中细胞同时进行IFA鉴定。2．2．2．6．4PK．15与EC细胞易感性比较首先将PK．15和EC两种细胞分别传于96孔细胞培养板，培养12h后，接种具有一定滴度的shimen血毒，37℃，5％C02培养60h，用80％冷丙酮进行固定，间接免疫荧光鉴定(IFA)，显微镜下管擦两种细胞感染灶的大小。2．2．2．7病毒滴度(TCID50)的测定为了评价CSFV的细胞传代适应性，实验对获得的每一代次的CSFV细胞毒进行滴度测定。将收集的细胞毒进行lOx梯度稀释至10击，每一稀释度作6个重复，即在720山30 山东农业大学硕士学位论文双无MEM或M199中加入80山病毒液。待细胞在96孔板中贴壁以后，将1oo山稀释好的病毒液加入到每一细胞孔中。培养板于374C，5％C02温箱中培养48h后，IFA测定细胞的病毒感染情况，使用Kiir：ber公式计算细胞病毒液的TCID50。K黏ber公式为：lgTCID50=L—d(s一0．5)其中，L=最高稀释度的对数；d=稀释对数之问的差；S=阳性孔比率总和。2．2．3基于猪瘟病毒流行毒株E2部分基因遗传多样性分析2．2．3．1猪瘟病毒流行毒株E2部分基因遗传多样性分析序列来源用欧盟CSFV诊断手册推荐使用的巢式PCR方法，对猪瘟病毒E2基因主要抗原区域(190bp)进行扩增，415份样中共检测到57份CSFV核酸阳性，利用1．5％琼脂糖凝胶对阳性样品内套PCR产物作胶回收，切下目的条带，用DNA回收纯化试剂盒(Promega公司)进行纯化后，纯化的PCR产物由吉林省库美生物科技有限公司进行序列测定，得到57条E2基因主要抗原区域序列(190bp)，参考GenBank上登录国内外猪瘟病毒序列69条(详细信息见表2)。表2CSFV毒株背景信息Table．2Detailedinformationoft_heisolatessequencedandusedforphylogenetieanalysis毒株地区分离年代基因型登录号参考文献strainsregionyeargenetypeaccession110．referenceHCL、，o中国19971．1HCU72048LiH等shimen6中国19971．1HCU72047TuC等PY_20090中国20091．1HQ380241ShenH等GDl4(95)‘广东19951．1TuC等GDI双98)c广东19981．1TuC等GD21(01)。广东20011．1TuC等GD25(02)。广东20011．1TuC等GDPZ-266+佛山平洲20111．1本研究GDLL-362+佛山勒流20111．1本研究GDZC-343+广州增城20111．1本研究GDZQ-336+肇庆20111．1本研究Bresciaa意大利19901．2M31768MoormannRJ等CS4俄罗斯19981．2AF099102GrebermikovaTV等BKK-915台湾19911．2AFl34208KitikoonP等CBR91‘泰国J9991．3AF24162IParchariyanonS等KKN88。泰国19991．3AF241623ParchariyanonS等Margaritab古巴20041．4AJ704817GangesL等0401。台湾20012．1aAY571074DengMC等 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查L119c老挝20032．1aAY283667BlacksellSD等Italyb意大利20012．1aAY027672Avalos．RamirezR等GX4(98)。广西19982．1aTuC等GZI(98)c贵州19982．1aTuC等HUN4(99)c湖南19992．1aTuC等TuC等SC4(99)。四川19992．1aTuC等GS．HG6甘肃19992。lbAFl43090LiuXT等GS·L1击甘肃19992．1bAFl43091LiuXT等GXBBl36广西20022．1bAY450273LuoTR等HNZH一201l。湖南201l2．1bJN886990JiangDL等HZ-05‘杭州20052．1bEF683629ChenN等TZ-05。泰州20052．1bEF683639ChenN等GD4(93)‘广东19932．1bTuC等GD5(94)。广东19942．1bTuC等GD7(97)c广东19972．1bTuC等GDl0(99)c广东19992．1bTuC等GDll09)‘广东19992．1bTuC等GDGY-41+佛山官窑20112．1b本研究GDLS-50‘佛山里水20112．1b本研究GDLc．176+佛山乐从20112．1b本研究GDPZ-148+佛山平洲20112．1b本研究GDBJ·155+佛山北浯20112．1b本研究GDSS·1564佛山三水20112．1b本研究GDTC-318+佛山潭村20112．1b本研究GDLP-349‘佛山乐平20112．1b本研究GDPY-189+广州番禺20112．1b本研究GDJM-45+江门20112．1b本研究GDQX-44+清远清新20112．1b本研究GDSH-206+肇庆四会20112．1b本研究GDSZ-126+深圳20112．1b本研究GDSZ-170+深圳20112．1b本研究GDGM-317+深圳公明20112．1b本研究GDYC-173'阳江阳春20112．1b本研究GDBL-24+惠州博罗20112．1e本研究GDShS-25+佛山狮山20112．1c本研究GDNH-26*佛山南海201l2．Ic本研究GDGM-54+佛山高明20112．1c本研究GDSS-55+佛山三水20112．1c本研究GDSS-311+佛山三水201l2．1c本研究32 山东农业大学硕士学位论文33 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查GXBBIo广西20022．1dAY450272LuoTR等GXBHlo广西北海20022。ldAY450271LuoTR等GDNH-19+佛山南海201l2．1d本研究GDShD·12+佛山顺德201l2．1d本研究GDSZ．18+深圳20112。ld本研究GDXQ-140+佛山西樵201l2．1d本研究GDSZ-291+深圳201l2．】d本研究GDZS-143+中山201l2．1d本研究c3D。意大利19942．2L36166LowingsJP等GXGZ020广西20032．2EF014334LuoTR等HUB-39*中国200l2．2AF407339WuHx等GD2(93)。广东19932．2TuC等TuC等GD6(96)。广东19962．2TuC等TuC等GD9(98)。广东19982．2TuC等GDl3(99)。广东19992．2TuC等TuC等AlfortI法国19892．3J04358RumenapfT等OR。意大利19982．3AJ312857BiagettiM等SS。意大利20002．3AJ312873BiagettiM等GDI(90)。广东19902．3TuC等TuC等GD3(93)。广东19932．3TuC等TuC等GDl5(85)。广东19852．3TuC等TuC等GDl6(98)。广东19982．3TuC等TuC等CongenitalTremorb英国19643．1JQ411575PostelA等Y19908。韩国20023．2AF521710SongJY等JJ9811。韩国20023．2AF521708SongJY等88039。韩国20063．2DQ656345ChaSH等NKP95-3。泰国20003．3AF241627ParchariyanonS等Kanagawac日本19743．4JQ411571PostelA等96．TWN-。台湾19963．4AY571103DengMC等p97c台湾19943．4L49347LiuS-1"aGenBank发表的CSFV全基因组序列；bGenBaak发表的E2基因序列；CGenBank发表的E2，基因部分片段}·本研究测得的E2基因部分片段，序列信息见附录。2．2．3．2基于猪瘟病毒E2部分片段序列生物信息学分析用DNASTAR(version7．1，Lasergene)软件包中序列编辑程序Editsiq程序对GenBank下载的序列进行处理，整理后获得126条长度为190bp的猪瘟病毒E2基因片段序列，再用软件包中MegAlign程序clustalX(version1．83)方法进行比对后，进行同源性分析， 山东农业大学硕士学位论文残基量表设置为identity。将所有的序列变成TXT格式，导入系统进化分析软件MEGA5(version5．05)，用clustalW方法进行多序列比对，自布值设为1000，遗传距离估算模型采用Kimura双参数法(Kimura2-parametermodel)模型，采用邻接法(neighbor-joining)构建系统进化树。2．2．3．32．1c分支年代估算本次测得2．1c流行毒株E2基因片段序列及参考序列共45条E2片段，按不同的来源分为五个小组：广西省(GX：3株)，老挝(LAO：2株)，泰国(Thailand：4株)，湖南(HN：3株)，广东(GD：36株)，估算时，毒株文件名后四位标注为流行毒株分离的年代，保存为seq格式的文件。首先，用DNASTAR软件包中多序列比对程序MegAlign，残基量设置为identity，用clustalW方法进行比后将结果保存为MSF文件，用clustalXl．83软件包clustalX程序运行MSF文件，将文件变为nxs格式再进行保存。分支年代估算软件为用Beastv1．5．4软件包，打开BEAUtiv1．5．4，将包含45条E2条片段序列的nxs文件输入，在BEAUti中进行相关参数设置：thetaxonsets中将不同地区的毒株E2部分片段序列分为5个GX(3株)，Lao(2株)，Thailand(4株)，HN(3株)，GD(36株)；Tipdates，选择usetipdates，在GuessDates进行年代标注，选择definedbyitsorder中的“last”选项，即可对不同年代的毒株进行标注；其他参数设置参考(Liu，2009)女1]下：1Sitemodels：GeneralTimeReversible(GTR)；Siteheterogeneitymodels：Gamma+Invariantsites；2clockmodel：relaxeduncorrelatedexponential：3treeprior：coalescent(exponentialgrowth)，theMCMCchain中chain长度设为10million。反复用BEASTv1．5．4软件运行三次，运行结果在Tracerv1．5软件中打开。2．2．4基于猪瘟病毒流行毒株E2全长基因遗传多样性分析2．2．4．1病毒株实验所用猪瘟样品(肾组织)由佛山科学技术学院吕宗吉老师提供，这些样品于2011年7月至9月收集自广东省佛山市等11个城市，经套式RT-PCR检测以及PK．15细胞分离鉴定为CSFV阳性样品，本次选取其中的16株代表毒株。2．2．4．2引物设计与合成根据不同基因型CSFV毒株全基因组序列的比对结果，利用Primer6．0和DNASTAR软件在E2基因两端的保守区域设计套式RT-PCR简并引物(引物详细信息见表3)，用于扩增E2全长基因，引物由Invitrogen(上海)贸易有限公司合成。 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查表3用于CSFVE2全长基因扩增的特异性引物Table．3Specificprimersusedforamplilyingthefull-lengthE2geneofCSFV$引物所在位置参考CSFVAlfortl87株全基因组序列(GenBank登录号：x87939)。+LocationofprimersreferringtothecompletegenomesequenceofCSFVstrainAlfortl87(GenBankaccession110．：X87939)．2．2．4．3RNA提取及ImPCR利用含双抗的MEM制备10％肾组织悬液，于4。C，13，000r／min离心10min，吸取200出上清至一新的离心管中，加入1mLTrizol试剂，参照TRIzolReagent试剂说明提取总RNA(Invitrogen公司)。以获得的总RNA为模板，利用M—MLV反转录酶进行反转录，所用的试剂均购自TaKaRa公司。反转录体系(20p1)的组成如下：5xM．MLVbuffer4．0111，dNTPMix(2．5mMeach)1．5m，随机引物(10mMeach)1．5山，RNase抑制剂(40U／I．t1)O．5斗l，M—MLV(200U／111)1．0山，DEPC．H201．5山，RNA模板10．0pl。反转录体系于42℃孵育1h，然后95℃煮沸5min以灭活反转录酶，获得的cDNA作为套式PCR反应的模板。PCR扩增所用的试剂均购白TaKaRa公司，反应体系为50gl：ddH2036．7pl，10xExTaqbuffer(M92+Plus)5．0肛l，dNTPs(2．5mMeach)4．0gl，Ex-Taq(5U／肛I)0．3“l，上、下游引物(10pM)各1．O¨l，模板2．0gl。PCR反应程序为：95。0预变性3min；35个循环(95℃，30s；54℃，1min；72。C，90s)；72℃延伸5min。利用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增的内套产物，切下目的条带，用DNA回收纯化试剂盒进行PCR产物纯化(Promega公司)，纯化的PCR产物由吉林省库美生物科技有限公司进行序列测定2．2．4．．4系统进化分析。利用DNASTAR软件编辑获得的E2全长基因序列以及比较不同毒株E2基因的核苷酸同源性大小和氨基酸序列的比对。利用系统进化分析软件MEGA5．05对本研究鉴定的16株CSFV流行毒株以及其它48株CSFV毒株进行遗传进化分析，序列分析所用的毒株信息见表4。36 ．一山东农业大学硕士学位论文——————————————————————————————————————二二．————一一表4CSFV毒株背景信息Table·4Detailedinformationoftheisolatessequencedandusedforphylogeneticanalysis毒株来源年代基因亚型。至丽————戛葡广———一strainsregionyeargenetypeaccessionno．references———————；；———————_：=1———————————·：-——————!———————————一一．．Alfort1878瑞士19951．1一恧两广—百莲丽再—一HCLV。中国19981．1AF531433YuX等LPC8台湾2001】．】AF352565ChangTJ等shimen。中国19981．1AF092448HuangQH等GDZC_343+广东增城20111．1本研究Bresciaa意大利19981．2AF091661KyleJ等CS4俄国20001．2AF099102GrebennikovaTV等RUCSFPLUM6美国20011．2AY578688BorcaMV等CSF03066马来西亚19861．3JQ411570PostelA等Margaritab古巴20041．4AJ704817GangesL等92·TCIo台湾20032．1aAY526726PanCH等96TD4台湾20042．1aAY554397DengMC等Ital扣意大利20012．1aAY027672Avalos．RamirezR等Paderbom3丹麦20092．1aGQ902941RasmussenTB等SXCDK4陕西20092．1aGQ923951LiL等SX·040浙江绍兴20042．1bEF683623ChenN等zj08023中国20082．1bFJ529205ZhengH等J}l·050浙江金华20052．IbEF683611ChertN等JXl-06b浙江嘉兴20062。lbEF683613ChenN等LS-050浙江丽水20052．1bEF683617ChenN等0406-TWN3台湾20042．1bAY568569DengMC等HEBZ8中国20092．1bGU592790YangR等HuZI-040浙江湖州20042．1bEF683605ChenN等HNZH．2011。湖南20112．1bJN886990JiangDL等Ⅸ·05。浙江嘉兴20052．1bEF683616ChenN等SXYL20068陕西20062．IbGQl22383ZhuXF等GXNNo广西南宁20012．1bAY430095LuoTR等GXWZ028广西梧州20022．1bAY367767LuoTR等HNHYIIo湖南20112．1bJQ001833JiangDL等Penevezys8立陶宛20092．1bHQl48063LeifcrI等GDJM-45+广东江门20112．1b本研究GDLC-176+广东乐从20112．1b本研究GDGY-41+广东佛山20112．Ib本研究GDGM-317+广东高明20112．1b本研究GDPZ-148+广东平洲20112．1b本研究37 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查a由GenBank发表的CSFV全基因组序列截得的E2基因序列；bGenBalll(发表的E2基因序列；+本研究测得的E2基因序列，序列信息见附录。38 山东农业大学硕士学位论文结果3．1广东省猪瘟病毒检测3．1．1广东省猪瘟疑似样本检测结果采用欧盟猪瘟诊断手册推荐使用巢式PCR方法，对来自广东省11城市415份猪瘟疑似病料(猪’肾脏组织样本)进行猪瘟病毒核酸检测，对内套PCR产物进行核酸琼脂糖凝胶电泳鉴定，共检出57份样本呈猪瘟阳性，其它358份样本呈猪瘟阴性，猪瘟检出率为13．7％。部分样本内套PCR产物核酸电泳结果见图3。M1234567891O112000bp1000bp750bp500bp250bp100bp图3部分样本猪瘟套式RT-PCR检测结果Fig．3TheCSFnestedRT-PCRresultofsomesamplesM：DL2000：l：阳性对照；2：GDLS．50,3：GDGM-54,4：GDSS．55；5：GDXQ一60；6：GDXQ．61；7：GDSZ．64．8：GDZC．67；9：GDDHu-68；10：GDSG．70；1l：阴性对照M：DL2000；1：positivecontrol；2：GDLS一5013-GDGM-54；4：GDSS-5515-GDXQ-60；6-GDXQ一61：7-GDSZ-64；8：GDZC-67；9-GDDHu-68；10．GDSG-70；1l：negativecontrol3．1．2猪瘟阳性样本混合感染检测结果为进一步检测猪瘟与其它常见猪病的混合感染情况，我们对猪蓝耳病病毒(PI汛SV)，猪圆环病毒2型(PCV-2)及伪狂犬病病毒(PRV)三种猪常见的病原体进行了检测，PCR结果显示：57份CSFV阳性样本中，32份同时患有CSFV、PRRSV、PCV-2三种疾病混合感染；23份为CSFV和PCV-2两种病毒混合感染，2份为PRRSV、PCV-2，1份只感染PRRSV，1份(GDZC．294)为CSFV、PRRSV、PCV-2、PRV四种疾病混合感染，猪瘟与猪圆环病毒2型和猪蓝耳病混合感染较为严重，与猪伪狂犬混合感染情况较轻。3．1．2．1猪蓝耳病病毒PCR检测结果57份猪瘟阳性样本中，34份同时感染高致病性猪蓝耳病病毒，部分核酸电泳结果见图4。39 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查2000bp1000bp750bp500bp250bpi00bpM1234567图4猪蓝耳病病毒PCR检测结果Fig．4ThePCRresultofPRRSVM：DL2000；1：阴性对照；2：阳性对照；3：GDZS．143；4：GDPZ．148；5：GDBJ-155：6：GDSS·156；7：GDYC-173M：DL2000；1：negativecontrol；2：positivecontrol；3：GDZS-143；4：GDPZ·148；5：GDBJ-155；6：GDSS一156；7：GDYC一1733．1．2．2猪圆环病毒2型PCR检测结果57份猪瘟阳性样本中，除GDZC．343为PCV-2阴性外，其余56份样本同时感染猪圆环病毒2型，部分核酸电泳结果见图5。2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM1234567图5猪圆环病毒2型PCR检测结果Fig．5ThePCRresultofPCV-2M：DL2000；1：阳性对照；2：GDNH．26；3：GDLS．50；4：GDSZ．53：5：GDZS．143；6：GDLL．362：7：阴性对照M：DL2000；1：positivecontrol；2：GDNH一26；3：GDLS-50；4：GDSZ-53；5：GDZS-143；6：GDLL-362；7：negativecon仃ol3．1．2．3猪伪狂犬病病毒PCR检测结果57份猪瘟阳性样本中，只检出GDZC．294同时猪伪狂犬病毒，部分核酸电泳结果见图6。 山东农业大学硕士学位论文250bp100bpM12345图6猪伪狂犬病毒PCR检测结果Fig．6ThePCRresultofPRVM：DL2000；l：阳性对照；2：GDZC．294；3：GDGM．317；4：GDSZ．18；5：阴性对照M：DL2000；1：positivecontrol；2：GDZC·294；3：GDGM·317：4：GDSZ-18；5：negativecontrol3．1．3猪瘟病毒流行毒株分离鉴定3．1．3．1病毒分离结果用PK．15和EC两种细胞分别从57份经巢式RT-PCR方法检测CSFV阳性肾脏组织中进行病毒分离，将病料研磨上清接种细胞后按照细胞正常传代的方法，带毒传至F5代，对每代带毒传代细胞用间接免疫荧光的方法(IFA)对猪瘟病毒流行毒株进行鉴定，在荧光显微镜下能够观察到绿色荧光，且这种荧光在细胞带毒传代过程中处于动态变化，可与不具增殖作用的非特异性荧光相区别，以此作为分离出猪瘟病毒的标志。我们用PK-15细胞分离出24株CSFV流行毒株，用EC细胞分离出23株毒株(部分IFA结果见图7、8)，两种细胞病毒分出率分别为42．1％，40．3％，23株分离毒株两种细胞分离结果一致，GDSH．206只用PK．15细胞分离出病毒，EC细胞未能分出病毒。24株猪瘟病毒流行毒株均为2．1亚型，2．1b亚亚型7株，2．1c亚亚型13株，2．1d基因型4株，毒株背景信息及3种基因亚亚型在广东省内分布见表5，2．1c和2．1d是我国广东省新出现的基因型，通过病毒分离，为今后研究我国广东省猪瘟病毒流行毒株分子生物学特性积累了宝贵的生物学材料。3．1．3．2BVDV检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)与猪瘟病毒(CSFV)同属，全基因组序列具有很高的同源性，与其它瘟病毒属成员存在血清学交叉反应，间接免疫荧光所用一抗为猪抗4lpp晖bb吧00屺O5m帅娜脚脚21 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查shimen血毒阳性血清为多克隆抗体，采用IFA很难将CSFV与BVDV区别开来，但是通过巢式RT-PCR技术对BVDV核酸进行检测可以它们区别开来，因此，有必要对分离出的猪瘟病毒流行毒株进行BVDV核酸检测，检测结果显示，广东省24株猪瘟分离株均为BVDV阴性，部分PCR鉴定结果见图9，证明分离出的流行毒株全部为猪瘟病毒。正常PK．15GDJM-45F2(2．1b)GDNH一19F2r2．1d)GDSZ一52F2(2．1c)GDTC一318F2(2．1b)阳性对照图7猪瘟病毒PK一15间接免疫荧光鉴定结果Fig．7TheresultofIFAusedPK一1542 山东农业大学硕士学位论文阴性对照GDSZ-18F2(2．1d)GDBL．24F2(2．1C)GDNH一26F2(2．1C)GDLC．176F2(2．1b)阳性对照图8猪瘟病毒EC间接免疫荧光鉴定结果Fig．8TheresultoflFAusedECAI+l2345678。图9牛病毒性腹泻病毒PCR检测结果Fig．9ThePCRresultofBVDVM．MarkerDL2000：+：阳性对照；l：GDNH．26：2：GDSZ．52；3：GDSZ．53：4：GDLC．176；5：GDGM．191；6：GDHD．369；7：阴性对照8：正常PK．15M：MarkerDL2000；+：positivecontrol；l：GDNH-26；2：GDSZ一52：3：GDSZ·53；4：GDLC—176；5：GDGM-191；6．GDHD-369；7：negativecontrol8：normalPK-1543 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查表5猪瘟病毒分离结果1’able．5Theresultofswinefevervirusisolation3．1．4PK．15与EC细胞猪瘟病毒易感性比较将滴度为105．18TCID50／0．1mL的猪瘟病毒石门株血毒，用细胞培养液做100倍稀释，100Itl／孔加入96孔板每孔中，每种细胞作4个重复孔，37"0，5％C02培养72h，用80％的冷丙酮固定后，作间接免疫荧光，在荧光显微镜下观察，从两种细胞感染的数量和形成的细胞感染灶大小来看，EC细胞的易感性较好，但是感染猪瘟病毒的PK．15细胞形成的荧光强度较EC细胞强，见图10。 山东农业大学硕士学位论文ECPK-15图10PK．15与EC的易感性比较Fig．10ThesusceptibilityresultofPK一15andEC3．1．5F2．F5猪瘟病毒在PK．15增殖特点3．1．5．1PK．15细胞感染率低时当猪瘟病毒感染PK．15细胞数量较少时(F2)，将细胞传于3个96孔板，37℃5％C02恒温箱中培养，分别24h、48h、72h后进行固定，做间接免疫荧光(IFA)通过观察感染灶大小，估计细胞感染数量的变化，从图11中看以看出当少量感染细胞存在时，进行带毒传代，PK一15细胞感染率随培养时间的增长感染细胞的数量成上升趋势，且感染细胞荧光较强，病毒适应性较好。3．1．5．2PK-15细胞感染率高时将感染猪瘟病毒的细胞传至F3代，从图12可以看出PK．15细胞几乎全部感染猪瘟病毒，此时，继续将细胞进行带毒传代，37V5％C02恒温箱中，分别24h、48h、72h后进行固定，做间接免疫荧光(IF'A)，从图12中可以看出感染猪瘟病毒的细胞荧光减弱，病毒适应性降低。 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查GDNH一19F224hGDNH一19F248hGDNH-19F272hGDBL一24F224hGDBL．24F248hGDBL-24F272h图11CSFV感染少量细胞时培养24h、48h、72h间接免疫荧光鉴定结果Fig．11TheIFAresultafterculture24h，48h，72hwhenfewcellsinfectCSFVGDSZ．18F324h≯i⋯”一、¨I|4一，^¨，}·i‘i，雾蛰。。、。。，≤‘洛‘2i_Y|．i≯。*。～GDSZ．18F348hGDSZ一18F372hGDBL．24F324hGDBL一24F348hGDBL一24F348h图12CSFV感染大量细胞时培养24h、48h、72h间接免疫荧光鉴定结果Fig．12TheIFAresultafterculture24h，48h，72hwhenallcellsinfectCSFV3．1．5．3F2．F5猪瘟病毒在PK-15细胞适应性变化将2．1c毒株接种PK．15细胞，第一次传代后病毒代次为F2代，按照此方法，一直传代至F5代，每代细胞固定后保存，F2．F5同时作间接免疫荧光，在荧光显微镜下 山东农业大学硕士学位论文观察，感染猪瘟病毒的PK．15细胞在F4代荧光最弱，F5代带毒细胞荧光有所加强，从图13可以看出F2．F5中间猪瘟病毒对PK．15细胞的适应性，有一个减弱的过程。GDNH．26F2GDNH一26F3GDNH一26F4GDNH一26F5GDHD一27F2GDHD一27F3GDHD．27F4GDHD．27F5图13F2．F5代带毒细胞培养72hCSFV间接免疫荧光鉴定结果Fig．13TheCSFVIFAresultafterculture72hofF2一F547 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查3．2广东省猪瘟病毒流行毒株遗传多样性分析3．2．1基于猪瘟病毒流行毒株E2部分基因系统进化分析基于猪瘟病毒流行毒株E2主要抗原区域编码基IN(190bp)序列进行系统进化分析，结果表明57株CSFV流行毒株中有4株基因型为1．1亚型，其它53株基因型均为2．1亚型，其中2．1b亚亚型16株，2．1c亚亚型31株，2．1d亚亚型6株。从系统进化树的拓扑结构(图14)可以看出，我国的2．1b毒株可大致形成8个进化支，GDQX．44、GDJM-45、GDSZ．126、GDSZ．170、GDYC．173、GDLC．176、GDPY-189一支；GDLP．349与湖南分离株HNZH．201l一支；GDGY-41与GDLS．50一支；GDPZ．148、GDSS．156、GDSH．206、GDGM．317、GDTC。318与2000年以前广东省流行过的猪瘟病毒流行毒株(GD4(93)、GD5(94)、GDl0(99)、GDll(99))形成一个分支；广西省GXBB13分离株和在广东省97年流行毒株GD7(97)株各单独形成一个分支；甘肃两株(GS．LT、GS．HG)和泰州TZ．05株，杭州HZ．05株分别形成两个分支，我国的2．1b亚亚型毒株位于共8个不同的进化分支上，广东省2．1b亚亚型16株猪瘟病毒流行毒株(“▲”表示本研究中毒株)分布于其中4个进化分支。另外，广东省猪瘟病毒流行毒株GDBL．24、GDShS-25、GDNH．26、GDGM．54、GDSS一55、GDSS-311、GDSS-315、GDXQ·60、GDXQ一61、GDXX-225、GDXX-292、GDXX．312、GDLP．293、GDNB．396、GDDG．224、GDHD．27、GDHD．369、GDZC．67、GDZC一294、GDSJ-30、GDJM一431、ODQV-180、GDQY-255、GDQY-298、GDSG-70、GDSZ．52、GDSZ．53、GDSZ．64、GDSZ．185、GDGM．191、GDDHu．68与泰国4株NIAHl419、NIAHl08478．1、NL蛆108478．2、NIAH712200株，老挝的两株(L403和IA04)，广东省08年，09年流行的两株(GDPY-2008、GDZH．2009)，广西省3株(GⅫH3、GXNNl、G删2)及湖南省3株(Ⅲ．2010、硼阱2011、删SD12)猪瘟病毒流行毒株形成另一个大的进化分支，我们将这一群毒株命名为2．1c亚亚型。此外，广东省猪瘟病毒流行毒株GDShD．12、GDSZ一18、GDNH．19、GDXQ．140、GDZS．143、GDSZ．291与分离自广西的两株猪瘟病毒流行毒株毒株(GXBBl和GXBHl)形成一个有别于2．1a、2．1b和2．1c的进化分支，我们将这一部分毒株命名为2．1d亚亚型。DengMC等(Deng等，2005)根据猪瘟病毒流行毒株核苷酸同源性首次将2．1亚型毒株划分为2．1a和2．1b毒株，基于猪瘟病毒流行毒株E2主要抗原区域编码基因190bp，2．1a与2．1b同源性为86．3．94．7％。新分出的2．1c亚亚型毒株与2．1a，49 山东农业大学硕士学位论文2．1b和2．1d毒株核苷酸同源性分别为88．4—93．2％，85．5—92．6％，88．9—92．6％。2．1d亚亚型毒株与2．1a，2．1b毒株核苷酸同源性92．1．94．2％，90．0—96．8％。2．1b与2．1d亲缘关系最近，核苷酸同源性最大96．8％，其它亚亚型毒株之间核苷酸同源性差别均大于3．2％。从系统进化树拓扑结构，自布值及核苷酸同源性将2．1亚型猪瘟病毒流行毒株划分为2．1a，2．1b，2．1c，2．1d。本研究中4株广东省猪瘟病毒流行毒株GDZQ．336、GDPZ．266、GDZC．343、GDLL．362为1．1亚型，其中GDZQ．336与01年，02年广东地区流行的毒株(GD21(01)、GD25(02))与shimen株核苷酸同源性100％，其他3株GDPZ．266、GDZC一343、GDLL．362与HCLV株核苷酸同源性很高，亲缘关系较近，上述结果证明1．1亚型毒株仍在该地区流行，本研究中没有出现2．1a、2．2、2．3亚型毒株。3．2．22．1c亚亚型流行毒株分支年代的估算将我国广东省新出现的33株2．1c亚亚型毒株，包括本研究中31株和GDPY-2008和GDZH．2009列为GD组，在广西省流行的3株猪瘟病毒流行毒株GXBH3、GXNNl、GXNN2列为GX组，湖南省流行的3株HN．2010、HNLY-2011、HNSD列为HN组，将在泰国流行的4株2．1c毒株NIAHl419、NIAHl08478．1、NIAHl08478．2、NIAH712200列为11lailand组，老挝流行的两株2．1c毒株L403，L404列为LAO组。根据猪瘟病毒流行毒株E2主要抗原区域编码基因190bp，通过Beastv1．5．4软件对2．1c亚亚型猪瘟病毒流行毒株进行分支年代估算发现(见图15)，距离2011年，2．1c亚亚型毒株，大约已经流行了将近18年，即从1993年开始流行。2．1c亚亚型毒株在我国广西省流行时间大约为17年，即大约在1994年开始在我国广西省流行；2．1c亚亚型毒株在老挝流行的时间大约为13．4年，也就是1997年开始在老挝流行；2．1c亚亚型毒株在泰国的流行时间约为10．2年，大约在2000年底，开始在泰国流行；2．1c亚亚型毒株分支年代估算结果显示，该类毒株在广东省流行时间约为5．3年，大约2005年下半年开始在广东省有流行∥旌’蛔哑亚型毒株在湖南省流行时间约为2．5年，推测大概在2008．2009年间开始在湖南省流行，我国广西省的2．1c最为古老，推测该类毒株可能最早起源于我国广西省。49 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查图14基于CSFVE2基因部分片段190bp系统进化树Fig．14PhylogenetictreebasedonthepartialE2genesequencesofCSFV▲本研究分离鉴定的CSFV流行毒株TrianglesrepresentCSFVisolatescharacterizedinthepresentstudy50 山东农业大学硕士学位论文tmre霉}IA0)l3{l‘tmrc3tlhailaAd》102S{tmrca1]fitl2．5{ltmrc3f锄)5．258图152．1c毒株分支年代估算结果Fig．15Estimationofdivergencedates3．2．3基于猪瘟病毒流行毒株E2全长基因系统进化分析基于猪瘟病毒流行毒株E2全长基因系统进化分析表明，16株CSFV流行毒株中有15株为基因2．1亚型，另外1株流行毒株GDZC．343为基因1．1亚型(见图16)。此前的研究将CSFV基因2．1亚型分为2．1a和2．1b两个亚亚型(Deng，2005)，GDGM一317，GDGY．41，GDJM．45，GDLC．176，GDPZ．148，GDSS一156和GDTC．318与其它2．1b亚亚型毒株一起形成一个进化支，而2．1a亚亚型毒株尚未发现在广东省流行。从系统进化树的拓扑学结构以及Bootstrap值可以看出，GDHD．369，GDJM．431，GDXX．292和GDZC．67与广东流行毒株(GDPY2008和GDZH．2009)、广西流行毒株(G)(BBl和GXBHl)以及湖南两流行毒株(}丑、『LY2011和HNSD12)形成一个独立的进化支，因此，将其命名为2。1c亚亚型(图16)。而GDNH．19，GDShD．12，GDSZ．18和GDZS．143与分离白广西的毒株GXBBl和GXBHl形成一个有别于以上3个2．1亚亚型的进化支，为此，将其命名为2．1d(图16)。为了进一步确定系统进化分析的结果，实验对不同的基因2．1亚亚型之间的核苷酸同源性进行了分析，结果发现2．1c和2．1a，2．1b和2．1d的核苷酸同源性分别为90．3．95．1％，90．2．93．7％和90．3．92．4％，2．1d与2．1a和2．1b之间的核苷酸同源性分别为91．4—94．5％和91．2．93．7％，其均低于2．1a与2．1b之间的核苷酸同源性(91．2．95．8％)，这些结果进一步证实了2．1c和2．1d亚亚型划分的准确性。3．2．4猪瘟病毒流行毒株E2蛋白氨基酸序列分析为了比较广东省目前流行的CSFV毒株与其它毒株在E2蛋白氨基酸水平上的差异，本研究对16株广东省CSFV流行毒株和其它48株毒株进行了E2蛋白的氨基酸51。'．1r-3．9n0。9一，一6一t●■tlOhr～1，拈簿0，麓毫d-Cn-rr～mt‘L． 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查序列比对。在CSFVE2编码的373个氨基酸中，有15个高度保守的半胱氨酸残基(Cys)，位于N．端(1．176aa)的6个Cys残基对E2蛋白的正确折叠与特异抗原决定簇的形成至关重要，Cys4与Cysl39形成一个推测的连接抗原结构域B区和C区的二硫键(VanRijn，1993；李红卫，1997)。多序列比对发现，本研究分析的64株CSFV毒株中，除LS．05株(2．1b亚亚型)发生Cys48Arg替换外(图17)，其它毒株E2蛋自的半胱氨酸残基都高度保守。作为CSFV重要的囊膜糖蛋白，E2含有5．7个潜在的N．糖基化位点，其参与蛋白的功能修饰。从图17中可以看出，118位，123位，187位，231位四个N．糖基化位点所有病毒亚型所共有，90位糖基化位点为1．1亚型毒株所特有。同时，1．1亚型强毒株Shimen和Alfort187株以及1．2亚型强毒株Brescia株，由于299位氨基酸发生了，n1H刖a替换，因此，不能形成潜在的299位N．糖基化位点，但该糖基化位点的缺失是否与病毒的毒力有关尚无报道。由于2．1b亚亚型毒株Ⅸ．05株229位氨基酸发生Asn---，Ser替换和HuB．39株231位氨基酸发生Tllr_Ile替换外，这两株病毒不能形成231位(229．231aa)N．糖基化位点，但其他毒株均含有该糖基化位点。值得注意地是，2．1b亚亚型毒株中GDGM．317，GDPZ．148，GDSS．156和GDTC一318的260位氨基酸发生了Asn---，Ser替换，未能形成262位N．糖基化位点，而本研究分析其它的CSFV毒株均存在此位点。通过E2蛋白的多序列比对，我们发现CSFV不同基因亚型毒株具有群特异性氨基酸替换。以2．1a亚亚型Paderbom株为参考株，与其它10个亚型毒株相比，2．1亚型毒株在Ala3Ser，Leu20Pro，Lys44Arg，Serl08Thr，Ar9156Lys，Glu270Gly处发生特异性替换。除上述六个位点发生替换外，2．1与2．2亚型相比，其特异性氨基酸替换还体现在Ser34Asn，Ile49Thr，Metl71lie，Gly240Asp，Ser268Leu。与2．3亚型毒株比较，2．1亚型毒株除上述六个群特异性氨基酸替换外，还在以下位点发生替换：Ser34Asn，Val47Ile，Asn88Ser，Asp95Gly，IlelllVal，Vall37Ile，Aspl58Glu，Tyr215Asp，Thr228Ala，Leu266His，Glu286Ala，Ile365Val。1．1亚型毒株特异性的氨基酸替换位点有Glu24Gly，Gly36Asp，Asp40Asn，Thr49Va!，Ser88Asn，Ala90Ser，Glu158Asp，Vall65Met，Thrl95Val，Leu268Ser，Arg303Lys。1．2亚型的特异性氨基酸替换则包括Tyr8His，Thr49Met，A曙72Asp，Ala90Leu，Phe105Tyr，Val165Arg。本研究结果显示，不同亚型毒株间E2蛋白某些氨基酸特异性替换位点存在差异，广东省近年来流行的CSFV2．1c和2．1d亚亚型毒株特有的氨基酸替换位点的数量甚至超过不同亚型，进一步表明2．1c和2．1d毒株分型的准确性。虽然CSFV各基 山东农业大学硕士学位论文因亚型毒株E2蛋白都具有群特异性氨基酸替换，但是这些氨基酸位点的替换对该蛋白的功能及病毒增殖和致病的影响目前尚未有报道。CSFVE2蛋白是诱导机体产生中和抗体的保护性抗原，其在AlkA2区含有一个单抗WH303特异的抗原表位(140—150aa)，在C．端保守区(177．373aa)存在一个线性表位(306—309aa)，前一个为CSFV特异性表位，后者则为瘟病毒属病毒成员特异性表位。此外，B细胞表位(64—70aa)和(82．85aa)分别位于抗原结构域B区和C区。多序列比对结果表明，CSFV各亚型毒株E2蛋白中这四个B细胞表位均高度保守(图17)。然而，B细胞表位4．1laa、28．35aa、82．90aa、103—124aa和155—176aa保守性较差且某些氨基酸位点存在群间差异，比如，2．1b亚亚型的广东流行毒株GDJM一45和GDLC．176的E2糖蛋白34位氨基酸发生Ser_A喀，导致B细胞表位28．35aa发生变化。彭伍平等(Peng，2008)通过对83至89位氨基酸残基进行替换以研究该B细胞表位对单抗的反应性，研究表明第88位氨基酸由Asn替换成Ser后，单抗与该表位反应性显著降低。与其它亚型的病毒株相比，CSFV2．1c亚亚型毒株E2囊膜糖蛋白88位氨基酸发生了Ser---，Thr替换，然而，该亚亚型氨基酸替换是否也引起B细胞表位的改变还有待研究。另外，猪瘟病毒2．1c毒株E2蛋白C端保守区(339．373aa)为跨膜结构域，该区第343位氨基酸Ⅶ一÷Ile，该位点的替换与欧洲经典强毒株Brescia株相同。2．1d亚亚型毒株与其它2．1毒株相比，特异的氨基酸替换有：Thr3Ser，Thr47Ile，Argl81Lys，Aspl92Asn，Asn210Asp，Gly249Ser，这些替换数量较多，但均不位于上述报道的抗原表位上，对该类毒株产生的影响有待进一步研究。 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查图16基于CSFVE2全长基因序列的系统进化树1．1Fig．16Phylogenetictreebasedonthefull-lengthE2genesequenceofCSFV▲本研究分离鉴定的CSFV流行毒株TrianglesrepresentCSFVisolatescharacterizedinthepresentstudy54 山东农业大学硕士学位论文l量2tb：量：，t●I羞‘21b，22t_土：，tItalyGD皿一369GDPY．2008GDZC一67GDZH．2009GD／M--4a1GDSZ—i8GDZS一143od06一TWNGDJ}45JH—05了x—05JXl--06LS—06S)【一04zj0801HNZH．20iiP㈣6zysS】(YL2006GDPZ一148C．DTC--318GDGY一41CSF0014JtmbulSp01ItalyGDPY．2008GDJM--43IGDJM--46JH—05丁】卜06Jxl一06Z】080iGDGY--41Jt，『山u1Sp01★1HcAlLlF“”．益鏊：fi鬲■：：焉嚣““～⋯RL!1S5TNElGPLG^EGLl3LQLDDGTVRAICTAGS-●●．．．．．．．．．．．．．I．．．●●-●-．．．．．．．．．．．．．I．．．●。‘．．．．．．．．．．．．．I．．．●--。●●●●_-●●●●●●●-．．1．．．．．．．．．．．T．．．．．．1．．．．．．．．．．T．．．．．．．1．．．．．．．．．．．T．．．．．．．1．．．．．．．．．．．T．．．．．．．1．．．．．．．．．．．T．．．．．．．1．．．．．．．．．．．T．．．．．●●-．．R．．R．-●●●●●●●-．．．．．⋯．．．T．．．．F●_●__●．．．R．．S．●●●．．．．．．．．．．．．R．．．．．．．≈．S．．．．．．．．S．．．．．．．．．●●●p●‘●●_●I．．DR．．-●-●●_-●●K．．．●●●D．．●-●D．．●_●D．．--●．．+D．．_-●．．．．．．．．．．．．．．T．．．．^S．VT．．．．．．．．．．，．K．．．I．．．．．^．．．．E．．．．K．．．I．．．．．^D一．T．．．．．．．N．．．．K．．．I．+．．．j．．．．．．．．L．．．．．．．．．．．．．．．．K．．．I．．．．．j．．．．．．．．L．．．．．．．．．．．．．．．．EV．．．．．．．^L．．．．．．．L．．．．．．．．．．．．⋯．K，V．．．．．．．H．．．．．．正V．．．．．．．^．S．．．．．．．．R．V．．．．．．．^．．．．．．．．L．．．G．．．D．．．N．．．．I【．．+V．．．0．^．．．．．．．．L．．．G．．．D．．．N．．．．K．．．V．．．．．^D．．．L．．．G．．．D．．．N．．．．K．S．V．．．．．^D．．．L．．．G．．．D．．．N⋯．K．S．V．．．．．^D．．．L．．．G．．．D．．．N．．．．K．T．V．．．．．^．．T．．．．．LH．．．．．．H．．．．．．．．X．．．巩．．．．．●．．．H．．．K．TN．．．．．．．．．．．．玳．．．．．^K．．L．．．．．．．H．．．．．．．．．．．．玳．．．L．．．．．．．H．．．．．．．．K．．．V．．．．．^．．．．．．．．L．．．．．．．N．．．．．．．IK．．．．．．．．．^．．．．．．．．L．．．C．．．D．．．．．．．．1【．．．S．．．．．^N．．．．．．．．IL．．．．．．．．月．N．．．．．．．．X．．．．．．．cPFDTIPw豫玳丫翟二u翟譬。：：：：：；：：：：：：：：：：：：：：：：．．．．．T．．．．．．．．．．．．．．．．一-r：：：：：；：：：：：：：：：：：：：：：：一⋯。。三‘i⋯⋯⋯⋯。：：i：．．．．．T．．．．．．．．^．．．．．．．个●T个cTS．S1cTcTcTc膏^．．V．．．．vc．Vo．Y．．S．S．wc55麓i；一恐嚣w饕vp一器箬w1fLzcecFIn一7誊囊蕊釜州工乏蒌幽垃漂盂 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查I￥-2lb’22t土23t●J}l工Tt^1ycDJM一45JH—05Jx—05Jxl一06Z】0801Ja直bulSp011801902002102．207KRE肝FP}m、n)CV’rTIvEl-口EI。FYcnGG警矿vKGNPvT‘rTGGQvl(qCRwGFDF髓PDG。PHYPIGK。．．．．．．．．．A．．．．．．．．．．．．．H一．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．R．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．I．．T．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．C．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．G．-．．．．．．．．．．．．．．．．．^．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．E．．．．．．．．．．．L．．．．．．．R．．．．．．．．．．D．．．．．．．．．．．．．．．．．N．．．．．．．．．．．．．．．．．．．R．．．．．．．．．．D．．．．．．．．．．．．．．．．．N．．．．．．．．．．．．，．．．．．．．．．．．M．．．．．．．．．．．．．．．R．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．N．．．．．．．．．．．．．．．．．．．R．．．．．．．．．．D．．．．．．．．．．．．．．．．．N．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．W．．．．．．．．．．．．^．孤．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．一．．．．．．．．．．．．G．．．．．．．．．．．．．．．W．．．．．．．．．．．．．．M．．．．．．．X．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．W．．，．．．．．．．．．．．M．．．．．．．K．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．R．．．．．．．．^．．．．．．．．．．．．．．．．W．．．．．．．．．．．．．．M．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．M．．．．．．．．．．．．．W．．．．．．．．．．．．．．M．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．w．．．．．．．．．．．．．．M．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．W．．．．．．．．．．．．．．M．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．W．．．．．．．．．D．．V．M．．．．．．．．．．．．Y．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．W．．．．．．．．．．．．I．M．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．L．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．M．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．A．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．D．．．．M．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．R．．．．．．．．^．．．．．．．．．．+．．．．．．．．．．．．．．．D．．．．M．．．．．．．．．．．．．．E．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．M．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．H．．．．．．．．．．．．D．．．．K．．．．．L．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．z．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．+．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．I．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．I．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．mI．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．E．．．．R．．．．＆．．．．．．．．．．．．．M．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．D．．．．Ⅲ．．R．．．．．．．．R．．．．．．Y．A．．．．．m．．．D．．．H．．．．．．．．．．．．D．．．．V．．．．．L．．．．．．．．．D．．．．．．．．．．．．．R．．．．．．Y．．．．．．．狐．．．K．．YH．．．．．．．．．．．．A．．．．z．．．．．．．．R．．．．．．Y．．．．．．．M．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．D．．．．I．．．．．．．．R．D．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．H．．．．．．．．．．．．D．．．．K．．．．．．．．．．．．．．．．．Y．．．．．．．．．．．R．D．．．．．．．G．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．D．．．．K．．．．．．．．．．．．．．．．．Y．．．．．．．．．．R．D．．．．．．．．．．．．．．．E．．．．H．．．．．．．．．．．．D．．．．R．．．．．．．．．．．．．．．．．Y．．．．．．．．．．．R．D．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．GR．N．K．．．．N．．．．C．L．．．．．Y．．．．+．．．．．R．．．．．．．．M．．．．．T．．N．．．．．．．．．．．．．．．．．E．．V．．．．．．．．．K．．．．．．N．．．．．．．．．．．．．．R．D．．．．．．M．．．．．T．．N．．．．．．．．．．．．．．．．．E．．V．．．．L．．．．．．．．．．．N．．．．．．．．．．．．．．R．D．．．．．．■．．．．．．．．N．．．．．．．．．．．．．．．．．E．．V．．．．V．．．．．．．．．．．DG．．．．．．．．．．．．R．D．．．．．．M．．．．．丁．．N．．．．．．．．．．．．．．．．．E．．V．．．．V．．．．．．．．．．．DG．．．．．．．．．．．．1LD．．．．．．Ⅻ．．．．T．．N．．．．．．．．．．．．．．．．．E．．V．．．．L．．．．．．．．．．．N．．．．．．．．．．．．．．R．．．．．．Y．R．．．．．T．．N．．．．．．．W．．．．．．．．．E．．．．．．．P．．．．．．．．．．．N．．．．．．．．．．．．．R．．．．．．．．R．．．．．T．．N．．．．．．．．．．．．．．．．．E．．．．M．．L．．屯．．．．．．．N．．．．．．．．．．．．．R．．．．．．．．R．．．．．T．．N．．．．．．．．．．．．．．．．．E．．．．x．．L．．R．．．．．．．．N．．．．．．．．．．．．．．R．．N．．．．．K．．M．．T．．NG．．．．．．．．．．．．．．R．E．．V．A．．P．．．．．．．．．．．N．．．．．．．．．．．．．．R．．．．．．．．K．．．．．T．．H．．．．．．R．．．．．．．．．．E．．I．．N．．．．．．．．．．．．．．＆∞．．．．．E．．．．．．．．．．．．Y．．．．．．．．．．．．．E．．I．．口k．．．．．．．GE．．．．M．．D．．．．N．R．．．．．．．．．．A．．．．．．．．．．凡．．．．．．．EV．．．．．．．．．．．．．R．．．．．．．．G．．．．．M．．D．．．．N．R．．．．．．．．．．A．．．．．．．．．．R．．．．．．．．日．．．．．．．．．．．．t●●—●．●●2do280260270280290300IL^NETCYRVVDTTDCNRDGV、rISTECE}lECLIG啊TTvKvH^LDGRLAP船CRPlCBIVSSAGPVRKTSC丁FNYtK．．．_．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．_．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．_．．．．．．．．．．．．．S．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．T．．．．．．．．．SP．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．I．．S．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．S．R．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．V．．．．．．．．．S．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．口．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．V．．．．．．．．．S．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．V．．．．．．．．．S．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．Q．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．S．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．y．．．．．．．．．S．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．V．．．．．．．．．S．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．S．．．．．．．．．．G．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．S．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．G．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．S．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．o．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．V．．．．．．．．．．．S．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．G．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．S．．．．．．．．．．．．．．G．．．．．．．．．．．．．．．．．．．G．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．S．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．G．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．S．．．．．．．．S．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．G．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．-S．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．G．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．-．．．．．S．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．G．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．S．．．．．．．．．．．．C．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．G．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．S．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．o．．．．．．．．．．．．E．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．S．．．．．N．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．G．．．．K．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．S．G．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．G．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．S．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．I．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．S．．．．．．．．．V．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．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山东农业大学硕士学位论文It41yGD3-，t一401一一⋯+--一⋯一+--⋯⋯一一·⋯一一⋯一⋯～一o3203303403150360370⋯⋯一一一一⋯*一一-⋯————一～——一⋯～————一⋯一一-一sY'FOQYnKGElYQY■FDLD、rrDHH。n)盯^EFv、几v、n，。ALLGGRYvLu『LIvTTIvL。TEqL^AG．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．V．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．一．一．．．．．．．．一．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．一．．．．．．．．．．．．．．．．．．V．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．^．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．^．．．．．．．．．．．．．，，．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．A．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．I．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．GA．G．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．L．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．C．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．、rI．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．A．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．1lrI．．．．．-●●-_●●●●●●●_●_●●-●-’-●●●●●----_-●●-●-_●●-●----●_●●●●．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．V．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．I．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．1．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．．．．．．I．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．15L．S．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．】5【．S．．．．．．．．．．．．．．．．．．．z．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．k．R．S．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．V．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．k．R．S．．．．．．．⋯．．．．．．．．．⋯．．．．．v．．⋯．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．A．．kS．．．．．．I．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．V．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．R．S．．．．．．I．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．R．S．．．．．．．⋯．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．⋯P．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．R．S．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．P．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．S．．．．．．．．．．m．．．V．．⋯．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．⋯S．．．T．．L．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．V．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．S．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．S．．．．．．．．．．．．．．．．．．．，．．．．．．．-．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．S．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．图17CSFV流行毒株E2蛋白的多序列比对“·”表示氨基酸与Paderbom株相同，字母表示差异氨基酸位点，已报道的抗原表位用方框表示，“一”表示氨基酸序列中潜在的N一糖基化位点，“★”表示15个Cys残基所在位置。Fig．17MultiplealignmentofdeducedaminoacidsequencesofCSFVglycoproteinE2．DotsindicatethesameaminoacidasPaderbomstrain，lettersindicatedifferentialaminoacidscomparedtoPaderbomstrain．Thereportedputativeepitopesareindicatedinpane．TheunderlinedaminoacidsarepotentialN—linkedglycosylationsites．The15Cysresiduesareindicatedbyasterisks．57酝r基 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查讨论4．1广东省猪瘟疑似样本检测4．1．1猪瘟其它三种猪常见病毒病混合感染严重猪瘟是由猪瘟病毒(ClassicalSwineFeverVirus，CSFV)弓I起的一种急性和高度接触性传染病，可导致各年龄猪发病，临床上以高发病率和高死亡率为特征。中国的猪瘟最早可追溯到上世纪20年代，此后数年，我国不断有猪瘟爆发的报道。自上世纪50年代，由于猪瘟兔化弱毒疫苗的应用，很好的控制了我国猪瘟的大规模爆发，同时由于疫苗的选择压力和猪瘟病毒对宿主的适应能力的选择作用，我国猪瘟发病特点发生了很大转变，主要以零星散发，低死亡率，发病周期长，持续感染为特征的温和猪瘟为主，并常常伴随与其它疾病的混合感染，成为导致该病具有高死亡率的重要原因。我国广东省是养猪大省，毗邻广西，湖南，江西，福建，海南五省，和台湾隔海相望，与老挝，泰国等南亚国家接壤，位于广东省深圳附近的香港澳门是与欧洲交流的窗口，地理环境复杂，为弄清我国广东省猪瘟病毒流行状况，本研究通过来自广州、东莞、佛山、清远、肇庆、深圳、韶关、惠州、中山、江门、阳江11个城市不同猪场415份疑似猪瘟样本，展开对我国广东省猪瘟流行病学调查，通过欧盟猪瘟诊断手册推荐巢式RT-PCR方法，共检出57份CSFV阳性样本，猪瘟阳性率为13．7％。为了弄清我国广东省猪瘟与其他疾病的混合感染情况，对这57份CSFV阳性样品进行猪蓝耳病病毒(PImSV)，猪圆环病毒(PCV)及伪狂犬病毒(PRV)三种猪常感染的病毒进行检测发现，32份有CSFV、PRRSV、PCV-2三种病毒混合感染，23份为CSFV和PCV-2两种病毒混合感染，1份是CSFV和PRRSV两种病毒混合感染；1份(广东增城GDZC一294)为CSFV、PRRSV、PCV-2、PRV四种疾病混合感染，从上述结果可以看出，我国广东省猪瘟病毒与其它病毒存在严重的混合感染是我国广东省猪瘟发病的重要特点。4．1．2猪瘟病毒细胞分离与培养猪瘟病毒(CSFV)流行毒株的细胞分离与培养是研究猪瘟病毒的基本手段，也是实验，．一r‘．一室检测CSFV最直接最可靠的方法，该方法不仅能为猪瘟分子流行病学调查提供宝贵的生物学材料，而且所培养的细胞毒也可用于猪瘟病毒疫苗的制备，降低了使用生产动物产生昂贵成本，便于工业化操作等优点，有利于推动动物福利事业的发展。猪瘟病毒的细胞分离很早便被广泛的应用，但是很少文章对猪瘟病毒的分离培养做很细致介绍，猪瘟流行病学调查工作的重点大都放到核苷酸和氨基酸序列分析上，往往 山东农业大学硕士学位论文忽略了流行病学调查中最基础的研究，本研究在猪瘟病毒分离与培养过程中发现，CSFV在细胞内生长繁殖规律具有自身的特点。以PK．15为例，猪瘟病毒在PK．15增殖，当少量感染细胞时，从间接免疫荧光鉴定结果可以看出，病毒对细胞的适应性良好，呈对数增殖，当感染率超过100％，继续带毒传代，虽然细胞感染率仍然很高，但是细胞质中荧光减弱，反映猪瘟病毒在细胞中的适应性减弱，病毒感染细胞可能依赖细胞内环境变化。对猪瘟病毒分离株的鉴定，传统方法是检测病毒核酸，此方法的弊端是不能区别病毒是否以活体存在，猪瘟病毒间接免疫荧光法(IFA)利用一抗与病毒在细胞内繁殖过程中表达的蛋白结合，然后用荧光标记的二抗与相应的一抗结合，不仅可以看到感染细胞的数量，根据荧光强弱还可以判断猪瘟病毒在细胞中的适应性强弱。在对带毒细胞传代过程中，由于病毒的增殖感染细胞的数量处于动态变化过程中，根据带荧光细胞的变化，可以准确判定是否分离出病毒，一般非特异性荧光不能随细胞代次的不同发生变化。但是间接免疫荧光检测也有自身的局限性，就是具有血清免疫交叉性，同一病毒属的其他病毒像牛病毒性粘膜腹泻病病毒(BovineⅥralDiarrheaVirusesl，BVDV-1)和BVDV．2、羊边界病病毒(BorderDiseaseVirus，BDV)，很难通过血清学反应进行区别，所以一般采用间接免疫荧光技术和病毒核酸检测技术相结合，对分离的病毒进行鉴定，从而大大提高了猪瘟病毒分离的准确率，从而大大提高了流行病学调查的效率。由于肾脏组织中具有感染能力的病毒量较低且多少不等，每次处理样品时反复冻融会造成CSFV的感染力下降，给病毒的分离带来很大的困难，尽管在CSFV分离过程，采取对研磨液上清进行分装保存，接毒研磨液上清前在冰上将其融化等方式，尽可能减少反复冻融造成具有感染能力的病毒数量减少。有些样品反复分离多次才成功分离出流行毒株，一次如果没有分离出CSFV，需再次进行CSFV分离，三次均未分离出病毒的样品，方可记作，未分离出CSFV。PK-15和EC在塑料细胞培养板上生长状态均比在玻璃细胞培养瓶中生长状态好，而PK．15细胞在两种培养器皿中生长状态相差不是很大，10mL细胞培养瓶细胞的数量多，接种相同体积的研磨上清，CSFV感染细胞的机率增大，有的毒株在F2代细胞感染率已经达到很高水平。不同流行毒株对细胞的适应性不同，同一种流行毒株对不同细胞的适应性也不相同。用IFA进行鉴定时，在PK．15细胞CSFV感染率比较低时，将同代次细胞，传于96孔板，37。C5％C02恒温箱中培养，分别24h、48h、72h后进行固定，通过间接免疫59 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查荧光(IFA)鉴定，观察细胞感染情况，当细胞感染率较低时，细胞带毒传代后，随着培养时间增长，培养72h细胞感染率达到最大。带毒传代24h固定的细胞，作IFA，感染细胞特点为，感染细胞单个存在，没有形成感染灶，原因可能是细胞内成熟的CSFV很少，主要存在未成熟的CSFV颗粒，短时间内病毒首先要完成遗传物质的复制，蛋白表达，组装，随后CSFV成熟后开始从细胞内外排，当少量细胞感染时(F1代)，一般无法从细胞培养上清中分离出病毒。将PK．15细胞感染率达到很高时，继续带毒传代，将传于96孔板的细胞，分别在24h，48h，72h固定，作间接免疫荧光鉴定发现，感染细胞荧光减弱，可能跟猪瘟病毒在细胞中适应性减弱有关。在对接种猪瘟病毒的PK．15细胞连续带毒传代(F2．F5)，对每一代细胞进行IFA鉴定发现，细胞感染率较低时，CSFV迅速感染周围正常细胞，增殖速度非常快，有的毒株在F3代即可感染全部细胞。感染细胞达到80％以上时，继续带毒传代(F4和F5)，进行IFA鉴定发现感染细胞数量急剧下降，F4代只有很少感染细胞，在F5代感染细胞数量和F4代相比又升高趋势，但是仍然没有F2和F3代感染率高，F2．F5带毒传代经历一个病毒适应性减弱的过程。通过CSFV分离对两种细胞进行比较，表明EC和PK-15细胞对CSF流行毒株均具有很好的易感性，但是接种相同滴度的CSFV，相同条件培养相同时间EC形成的感染灶较大。EC细胞属于比较年轻的细胞系，用做IFA鉴定具有非特异性荧光少，结果准确，容易判定等优点，可用作猪瘟病毒流行毒株的抗原性分析，鉴定一般采用接毒的方法。CSFV流行毒株的分离丰富了我国广东省CSFV流行毒株病毒库，为该地区CSFV分子流行病学研究及其它相关研究提供宝贵的生物学材料，初步探索CSFV在细胞中的增殖特点为获得高适应细胞的细胞毒提供思路，此外，对建立我国流行毒株之间联系及今后研究我国CSⅣ流行毒株时空分布的动态变化具有重要的意义。4．2广东省猪瘟病毒流行毒株遗传多样性4．2．1基于猪瘟病毒流行毒株E2部分基因系统进化分析猪瘟病毒只有一个血清型，基因进化谱较窄，系统进化分析越来越多的被应用到CSFV分子流行病学调查研究中，广泛的用于猪瘟病毒基因的分型，分析不同毒株之间 山东农业大学硕士学位论文的亲缘关系，追踪CSFV流行毒株传播模式和毒源，发现CSF防控的薄弱环节等方面(Paton，2000)。1996年Lowing等(Lowings，1996)根据猪瘟病毒E2主要抗原编码区域(190bp)进行系统进化分析，将猪瘟病毒分为两个大群，5个亚群。Paton等(Paton，2000)根据这段基因将猪瘟病毒分为三个大群，10个基因亚群。涂长春等(Tu，2001)基于E2部分片段序列将中国猪瘟病毒分为1．1、2．1、2．2、2．3四种基因型，其中1985年至2002年间流行于广东省17株，其中有4株GDl4(95)、GDl8(98)、GD21(01)、GD25(02)为1．1亚型，4株GD2(93)、GD6(96)、GD9(98)、GDl3(99)为2．2亚型，4株GDI(90)、GD3(93)、GDl5(85)、GDl6(98)为2．3亚型，5株GD4(93)、GD5(94)、GD7(97)、GDl0(99)、GDll(99)为2．1b亚亚型。本研究中广东肇庆一株GDZQ一336与在广东省01年，02年流行的两株(GD21(01)、GD25(02))与shimen株核苷酸同源性为100％，与95年，98年，09年在广东省流行GDl4(95)、GDl8(98)、PY-2009株核苷酸同源性也极高，证明1．1亚型毒株在我国广东省仍在流行，从所占比例和数量来看，流行规模有所减少。本研究在广东省发现的57株流行毒株中，没有出现2．2，2．3亚型毒株，推测该两种亚型在该地区沉默。16株2．1b亚亚型毒株中，清远市清新县GDQX．44株、广东省江门GDJM．45株、广东深圳GDSZ．126株、GDSZ．170株、阳江市阳春GDYC一173株、佛山市乐从GDLC．176株、广州市番禺GDPY-189株与浙江杭州HZ．05同源性很高，95．8．96．8％，推测可能由浙江省通过引种等方式传入广东省。广东省乐平GDLP．349株与湖南分离株HNZH．2011同源性为100％。广东省高阳GDGY-41株与广东里水GDLS．50株同源性100％，单独一进化分支，与其他2．1b同源性最高只有94．7％，推测可能由其它地方传入。佛山平洲GDPZ．148株、三水GDSS一156株、肇庆市四会GDSH一206株、深圳公明GDGM．317、佛山市潭村GDTC．318株与2000年以前广东省流行过的猪瘟病毒流行毒株(GD4(93)、GD5(94)、GDl0(99)、GDll(99))形成小分支，同源性很高，表明以前在广东省流行的2．1b仍在流行。31株2．1c亚亚型猪瘟病毒流行毒株中，惠州市博罗GDBL．24株，广州增城GDZC．67株，广州市花都GDHD．369株，肇庆市鼎湖GDDHu-68株与08年，09年在广东省流行的两株广州番禺GDPY-2008株和广东珠江GDZH．2009株具有很高的同源性，亲缘关系最近，证明08年2．1c亚亚型毒株已经开始在我国广东省开始流行。佛山市狮山GDShS．25株，佛山市南海GDNH．26株，深圳市高明GDGM．54株，佛山市三水GDSS．55株、GDSS．311株、GDSS．315株，佛山市西樵GDXQ．60株、GDXQ一61株，佛山市仙溪 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查GDXX．225株、GDXX．292株、GDXX．312株，佛山市乐平GDLP一293株，佛山市南边GDNB一396株，广东东莞市GDDG．224株，广州花都GDHD一27株，广州增城GDZC一294株，江门市三江GDSJ．30株、广东江门GDJM．431株，广东清远GDQY-180株、GDQY-255株、GDQY-298株，广东韶关GDSG．70株，广东深圳GDSZ．52株、GDSZ一53株、GDSZ．64株、GDSZ．185株，深圳市公明GDGM一191株与湖南省3株，HN一2010株，HNLY-2011株、HNSD12株猪瘟病毒流行毒株同源性最高，亲缘关系最近，湖南省与广东省交界，推测为两省猪瘟病毒流行毒株交流频繁所致。此外，本研究佛山市顺德GDShD．12株，广东深圳GDSZ．18株，佛山市南海GDNH．19株、佛山市西樵GDXQ．140株，广东中山市GDZS．143株，广东深圳GDSZ一291株与分离自广西的两株猪瘟病毒流行毒株毒株GXBBl株和GXBHl株核苷酸同源性极高，单独形成不同于其它3种亚亚型的进化分支，为方便说明我国广东省遗传多样性，我们将其定为2．1d，这部分流行毒株，数量极少，可能最早由广西北海通过引种传入广东省，目前在广东省流行的范围很小，只在佛山，中山，深圳发现该类毒株。综上所述，对我国广东省CSF进行流行病学调查发现，该地区猪瘟病毒1．1亚型毒株流行规模在减小，但是仍然在该地区流行；2．2，2．3亚型毒株可能在该地区沉默，仍然没有2．1a亚亚型毒株在广东省流行；通过系统进化分析可以看出，我国广东省猪瘟病毒与周边包括广西、湖南、江西、福建，浙江等地猪瘟病毒通过引种，贸易等方式存在频繁的基因交流，提示我国广东省猪瘟的防控应加强检验检疫。2．1c和2．1b毒株是引起广东省猪瘟最主要的流行毒株，这些结果对该地区CSF防控提供一些理论根据。4。2。22．1c亚亚型流行毒株进化分支年代估算通过对2．1c亚亚型毒株之间同源性比较，可以看出我国2．1c亚亚型毒株与泰国，老挝国该类毒株具有很高的同源性，这一类毒株群间同源性也很高，94．2．100％。最早报道2．1c亚亚型毒株是广西北海GXBH3株，1998年由涂长春研究员及吕宗吉等测得，当时这类毒株数量较少，只将其基因型列为2．1亚型，没有进一步精确分型。此后1999年南亚的老挝国也出现该类毒株，2002年，罗廷荣等研究在广西发现这类毒株还在流行，2003．2008年泰国均有这类毒株引起猪瘟爆发的报道，2011年，余兴龙等发现这类毒株在湖南也有流行，有证据表明2008年这类毒株已经在广东省流行，本研究中2．1c数量甚至超过了我国广东省优势毒株2．1b，该类毒株可能跟广东省最近的猪瘟散发流行有关，随流行的过程中，2．1c亚亚型毒株有可能代替2．1b成为我国广东省优势猪瘟病毒流 山东农业大学硕士学位论文行毒株。为弄清2．1c亚亚型这一新型毒株流行时间和在这些地区的传播途径进行追踪，根据2．1c亚亚型毒株E2主要抗原编码基因(190bp)，我们用Beastv1．5．4软件对该类毒株进行分支年代的估算，初步估算这类毒株的流行时间为18年，大约1993年开始流行，大约在1994年开始在我国广西省流行，1997年开始在老挝流行，大约在2000年底，开始在泰国流行，大约2005年下半年开始在广东省有流行，大概在2008．2009年间开始在湖南省流行，我国广东省和湖南省2．1c亚亚型毒株可能最早由广西省传入，也可能从广西省传入广东省，再传入湖南省。我国广西省是中国同南亚国家交流的窗口，老挝，泰国出现的2．1c亚亚型毒株可能与最早起源于广西省2．1c亚亚型毒株有某种联系。2．1亚株毒株最早1986年被发现于南亚的马来西亚，2．1a毒株最早1994年分离自台湾，而2．1c亚亚型毒株估计最早1993年开始在我国广西省流行，所以推测该群毒株不是由2．1a或2．1b亚亚型进化而来，而是同2．1a和2．1b为平行亚种通过长期的流行，数量逐渐增多，并发展成为我国广东省内最主要的流行毒株。4．2．3基于猪瘟病毒流行毒株E2全长基因遗传多样性分析猪瘟是严重危害我国养猪业的一种烈性传染病。在我国，猪瘟兔化弱毒疫苗的推广使用使我国猪瘟的大规模流行得以控制，然而，猪瘟的散发在我国各省市时有发生，每年对养猪业造成巨大的经济损失，因此，采取切实有效的防控措施势在必行。CSFV分子流行病学研究是CSFV溯源和控制猪瘟的有效工具，其有助于猪瘟防控策略的制定。上世纪90年代末，军事兽医研究所涂长春研究员率先对我国各省市CSFV流行毒株进行了系统进化分析，证实了我国存在1．1、2．1、2．2和2．3亚型CSFV毒株的流行，其中分析的1990—1999年广东省CSFV流行毒株均为基因II群(2．1，2．2和2．3亚型)。在此之后，华南农业大学的学者通过系统进化分析显示其在2008．2010年分离的14株广东省CSFV流行毒株均为1．1亚型(Shen，2011)。为了充分掌握该省CSFV流行毒株的遗传本底，我们从‘2011年吕宗吉老师送检的57份阳性样品中挑选了16’株CSFV，流行毒株进行了E2全长基因测序和系统进化分析，结果表明只有一株病毒为基因1．1亚型，其它15株为2．1亚型，根据该亚型不同毒株间的核苷酸同源性大小，这15株2．1亚型病毒被进一步划分为2．1b，2．1c和2．1d三个亚亚型，后两个亚亚型毒株为首次报道在广东省流行，而此前流行的2．2和2．3亚型毒株在本次猪瘟流行病学监测中尚未发现。这些结果表明广东省CSFV流行毒株具有遗传多样性，同时，2．1c和2．1d亚亚型毒株的出现 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查使该地区猪瘟的防控提出新的问题，在此前的研究中，5’-NTR的150个核苷酸，E2基因的190个核苷酸和NS5B基因的409个核苷酸片段常用于CSFV的基因分型和分子流行病学研究，由于这些基因片段较短，其含有的信息有时很难区分亲缘关系较近的毒株。据Postel(Postel等，2012)报道，利用E2全长基因序列进行系统进化分析所取得的结果优于基于CSFVE2基因片段的分析，为此，本研究对CSFV流行毒株进行了E2全长基因的扩增，序列测定和系统进化分析。核苷酸同源性比较显示，新分型的2．1c和2．1d与其他2．1亚亚型毒株之间的同源性要低于已有的2．1a和2．1b之间的同源性。此外，2．1c和2．1d与其它亚亚型相比具有其特有的氨基酸替换。2．1c与2．1a相比，差异的氨基酸位点为(以Paderbom株为参考，见图17)：nlr88Ser，Val90Ala，Ile343Val；2．1c与2．1b的差异氨基酸位点为：Lys31Arg，Asn34Ser，Thr56Ile，Leul82Trp，Thrl97Met，Ala273Gly。2．1d亚亚型毒株与2．1a相比，特异的氨基酸替换有：Thr3Ser，Thr47Ile，Ile5611lr，Val90Ala，Argl81Lys，Aspl92Asn，Asn210Asp，Gly249Ser。2．1d与2．1b的差异氨基酸位点有：Thr3Ser，Thr47Ile，Val90Ala，Ilel08Thr，Argl81Lys，Trpl82Leu，Aspl92Asn，Metl97Thr，Asn210Asp，Gly249Ser，Gly273Ala。2．1d与2．1c相比特有的氨基酸替换有：Thr3Ser，Thr47Ile，Ile56Thr，Ser88Thr，Argl81t,ys，Aspl92Asn，Asn210Asp，Gly249Ser，Val343Ile。以上结果显示，2．1c和2．1d亚亚型毒株与2．1a和2．1b亚亚型毒株之间在氨基酸水平上具有一定的差异，其中一些氨基酸替换为2．1c和2．1d亚亚型所特有，结合2．1亚型之间的核苷酸同源性大小，为CSFV2．1c和2．1d亚亚型的划分提供了依据。本研究分析的16份猪瘟阳性病料是对广东省中部地区部分城市辖区、县猪瘟发病猪场或散养户进行流行病学调查后，从57份阳性样品中选取的具有代表意义的病料，其它阳性样品仅进行了E2基因片段的扩增和序列测定(核苷酸同源性超过99．5％在文中未显示)。基于E2基因片段的系统进化分析显示，CSFV2．1b亚亚型流行毒株除在佛山、江门和深圳外，广州、清远、阳江和中山等地也均有流行；CSFV2．1c亚亚型流行毒株除佛山、广州和江门外，东莞、惠州、清远、韶关、深圳、肇庆等市也有该亚亚型’毒株流行；2．1d亚亚型CSFV流行毒株仅佛山，深圳和中山出现该类毒株，而且数量相对较少。2．1c和2．1d分别最早于1998年和2002年发现在我国广西省北海市流行，然而，北海市流行的毒株与广东省2．1a和2．1b亚亚型毒株之间的关系尚不清楚。由于广西北海市是与广东省交界，同时广东省很多猪场从广西购买仔猪或引种，在此过程中可能从广西传入广东省。2．1c在广东省中部地区的流行呈上升趋势，成为该地区仅次于2．1b 山东农业大学硕士学位论文亚亚型的优势流行毒株。同时，2．1c毒株还与湖南省分离株HNLY．2011和HNSD12以及泰国和老挝流行毒株关系较近。由于广东与广西和湖南为相邻省份，交通便利，贸易往来频繁，这些条件为CSFV流行毒株的传播提供了便利。广东省CSFV流行毒株遗传多样性分析提示猪瘟防控不仅要加强本省各县市之间CSFV阳性猪的检疫，还要对广东省与相邻省份和东南亚国际在引种和贸易往来等过程中加强检验检疫。2．1b毒株GDGM．317，GDPZ．148，GDSS一156和GDTC．318在进化树上形成一个独立的分支，这些毒株与2．1b亚亚型其它毒株、2．1a、2．1c、2．1d毒株E2基因核苷酸／氨基酸序列同源性分别为92．6．94．9％／95．4．97．9％，91．2．93．6％／95．2．97．3％，91．2．92．2％／95．3．97．6％，91．2．92．1吲95．3—96．2％，尽管这些毒株的E2核苷酸和氨基酸同源性相差很大，但是从系统进化树拓扑结构还不能进一步划分为新的亚亚型。据报道CSFV野毒株之间会发生同源重组，进而导致基因突变(He等，2007)，本研究鉴定的病毒GDGY-41，其E2基因核苷酸序列同源性与陕西2．1b亚亚型流行毒株SXYL2006关系较近，但E2糖蛋白氨基酸序列与II群中2．1、2．2、2．3亚群毒株差异均很大，该毒株是否发生了基因重组尚需进一步研究。65 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查结论1．广东省猪瘟采集样本中阳性率为13．7％，与PCV-2和高致病PRRSV混合感染十分严重，与PRV混合感染较轻，猪瘟与其它疾病的混合感染是当今广东猪瘟防控严峻的问题之一；2．通过遗传进化分析，将CSFV流行毒株2．1亚型划分为2．1a，2．1b，2．1c和2．1d四种亚亚型，并证明我国广东省CSFV流行毒株遗传多样性发生变化，2．1c和2．1d为新出现的基因型；3．2．1c毒株有重要抗原表位发生改变，部分2．1b毒株第262位N．糖基化位点丢失，2．1d毒株E2蛋白氨基酸特异性替换位点超过不同亚型毒株，这些数据为我国广东省猪瘟防控策略的制定提供了科学依据；4．用PK．15和EC两种细胞从原始病料中分离获得24株CSFV流行毒株，2．1b7株，2．1c13株，2．1d4株，2．1b中GDGM．317、GDTC．318两株，其E2蛋白第262为N-糖基化位点丢失，另外还获得一株GDGY-41株，该毒株有可能发生基因重组；5．猪瘟病毒体外感染细胞，内环境改变可能是必需条件，带毒传代缺乏此过程，故CSFV细胞毒滴度很难达到很高，这为获得高滴度和高适应细胞的CSFV株提供了思路。 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广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查classicalswinefevervirusinChina．Virusresearch，2001，(81)：29-37UttenthalA．，StorgaardT．，OleksiewiczM．B．anddeStrickerK．ExperimentalinfectionwiththePaderbomisolateofclassicalswinefevervirusin10--week·-oldpigs：determinationofviralreplicationkineticsbyquantitativeRT-PCR，virusisolationandantigenELISA．Veterinarymicrobiology,2003，(92)：197—212VanGennipH．，VlotA．，HulstM．，DeSmitA．andMoormannR．DeterminantsofvirulenceofclassicalswinefevervirusstrainBrescia．Journalofvirology，2004，(78)：8812-8823VanRijnP．，MiedemaG，WensvoortG，VanGennipH．andMoormannR．AntigenicstructureofenvelopeglycoproteinE1ofhogcholeravirus．Journalofvirology，1994，(68)：3934．3942VanRijnP．，VanGennipH．，DeMeijerE．andMoormannR．EpitopemappingofenvelopeglycoproteinE1ofhogcholeravirusstrainBrescia．Journalofgeneralvirology，1993，(74)：2053—2053VanRijnP．A．，VanGennipR．P．，deMeijerE．J．andMoormannR．J．ApreliminarymapofepitopesonenvelopeglycoproteinE1ofHCVstrainBrescia．Veterinarymicrobiology,1992，(33)：221-230VilrekS．，StadejekT．，BaUagi-PordanyA．，LowingsJ．，PatonD．andBelakS．Geneticvariabilityofclassicalswinefevervirus．Virusresearch，1996，(43)：137—147WeilandE．，StarkR．，HaasB．，RiirnenapfT．，MeyersQandThielH．-J．Pestivirusglycoproteinwhichinducesneutralizingantibodiesformspartofadisulfide—linkedheterodimer．Journalofvirology,1990，(64)：3563-3569WensvoortGTopographicalandfunctionalmappingofepitopesonhogcholeravirus晰mmonoclonaiantibodies．Journalofgeneralvirology，1989，(70)：2865-2876WindischJ．M．，SchneiderR．，StarkR．，WeilandE．，MeyersQandThielH．一J．RNaseofclassicalswinefevervirus：biochemicalcharacterizationandinhibitionbyvirus-neutralizingmonoclonalantibodies．Journalofvirology,1996，(70)：352-358XiaoM．，ChenJ．，WangY，ZhenY，LuW：andLiB．Sequence，necessaryforinitiatingRNAsynthesis，inthe3'-noncodingregionoftheclassicalswinefevervirusgenome]．-”⋯Molekuliarnaiabiologiia，2004，(38)：343XiaoM．，GaoJ．，WangY，WangX．，LuW：，ZhenY，ChenJ．andLiB．Influenceofa12-ntinsertionpresentinthe3’untranslatedregionofclassicalswinefevervirusHCLVstraingenomeonRNAsynthesis．Hrusresearch，2004，(102)：191-198XiaoM．，WangY，ZhuZ．，YuJ．，W抽L．andChenJ．InfluenceofNS5Aproteinofclassicalswinefevervirus(CSFV)onCSFVinternalribosomeentrysite—dependenttranslationl76 山东农业大学硕士学位论文Journalofgeneralvirology,2009，(90)：2923-2928XuJ．，MendezE．，CaronP．R．，LinC．，MurckoM．A．，CollettM．S．andRiceC．M．BovineviraldiarrheavirusNS3serineproteinase：polyproteincleavagesites，cofactorrequirements，andmolecularmodelofanenzymeessentialforpestivirusreplication．Journalofvirology，1997，(71)：5312—5322YuM．，WangL．一F．，ShiellB．J．，MorrissyC．J．andWestburyH．A．FinemappingofaC—terminallinearepitopehighlyconservedamongthemajorenvelopeglycoproteinE2(gp51togp54)ofdifferentpcstiviruses．Virology，1996，(222)：289—292 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查致谢时光如隙，三年时光转瞬而过，这三年实现我由对学术的懵懂到深刻认识的蜕变，回首曾经美好的时光充实而烂漫，庆幸当初考研真是一种幸运。在这里我要谢谢三年来启蒙我、引导我、帮助我、激励我的各位老师和同学。首先我要感谢我的硕士生导师胡敬东副教授，在我读硕士期间胡老师从生活上、学习中给我莫大的帮助，师恩终身难忘。胡老师认真负责的工作态度、渊博的学识、豁达的胸襟、严谨的治学作风深深地感染着我们，谢谢您三年来的悉心指导，在此向胡老师表达我最诚挚的敬意和谢意，老师您辛苦了!本论文是在长春军事兽医研究所完成，谢谢贵单位提供的先进平台，使我得以顺利完成学业。特别感谢涂长春研究员，涂老师在生活和工作中给予我极大帮助，他严谨务实、学识渊博、高风亮节的品质对我影响至深。感谢郭焕成老师的大力帮助，从您身上我学到很多为人处世的道理。感谢龚文杰老师给予我学术启蒙、科研思维和无微不至的关怀。感谢广东省佛山科学技术学院吕宗吉副教授提供样本!感谢山东农业大学动物科技学院各位领导、老师对我的培养!感谢预防兽医学系崔治中教授、赵宏坤教授、赵孝民教授、牛钟相教授、柴同杰教授、崔言顺教授、常维山教授、刁有祥教授、朱瑞良教授、姜世金教授、柴家前副教授、孙淑红副教授、谢之景副教授及吉林大学张茂林老师在学习和工作中给予的关心与帮助!感谢曹永国博士、冯烨博士、何彪博士、孔娜博士、谢金鑫博士、杨知博士、朱妍博士、陈雪锋硕士、戴雅娟硕士、范忠玲硕士、李方正硕士、李恩扩硕士、刘帅硕士、马健硕士、苏倩倩硕士、唐亮硕士、王文娟硕士、王肖神硕士、夏乐乐硕士、席进硕士、杨凡力硕士、余乐硕士、尹凝硕士、张思春硕士、张海滨硕士、赵建文硕士、周明东硕士、周霞硕士等同学给予的帮助与支持!感谢我的室友毕崇亮硕士、姜庆利硕士、刘明超硕士、刘广臣硕士、王金辉硕士、王茂鹏硕士，．袁鹏硕士、仲锋硕士，感谢你们的帮助!感谢吉林大学崔鹤馨硕士、乔斌硕士、黄飞硕士、张瑞硕士、赵丽丽硕士、吉林农业大学崔雨明硕士，军事兽医研究所王淑珍大姐、信秀芹大姐、李莹莹、刘佳丽以及本实验室王相芹等师弟师妹在试验中的大力帮助，祝福你们一生幸福!最后，我要特别感谢我的祖父彭学周、祖母张文风，还有默默支持我读书的父母及其他亲人!感谢他们的养育之恩和理解178 山东农业大学硕士学位论文攻读硕士学位期间发表的论文彭志成，龚文杰，吕宗吉，胡敬东，郭焕成，涂长春．广东省猪瘟病毒流行毒株遗传多样性分析【J]．中国兽医学报，2013，已录用；余乐，张思春，彭志成，杨知，谢金鑫，涂长春．Shotgun技术筛选与猪瘟病毒E2蛋白相互作用的猪血管内皮细胞蛋白[J】．中国预防兽医学报，2012，已录用；苏倩倩，王肖神，李恩扩，彭志成，胡敬东．鸡白细胞介素18成熟蛋白的表达、纯化及其单克隆抗体的制备与特性鉴定【J]．中国兽医学报，2013，33(5)：684．688． 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查附录本研究57株CSFV流行毒株E2部分基因序列信息：GDLL．362CACCACCACCTGGAAGGAAI'ACAACCACGA兀_rGCAACTGAATGACGGGACCGTCAAGGCCAGTTGCGTGGCAGGTTCCrrTAAAGTCAI’AGCACl_rAATGTGGTCAGTAGGAGGTAmGGCGTCATTGCpⅡtAAGAAGGClTTACCCACTTCCGTGACA丌CGAGCTCCTGTTCGACGGGACCAACCCAGDPZ．266CACCACCACCTGGAAGGAATACAATCACGAr丌GCAACTGAATGACGGGACCGTCAAGGCCAGTTGCGTGGCAGGTTCCrrTAAAGTCACAGCACTrrAATGTGGTCAGl’AGGAGGlATTTGGCGTC√气TTGCAlAAGAAGGCTTTACCCACCTCCGTGACATTCGAGCTCCTGTTCGACGGGACCAACCCAGDZC．343CACCACCACCTGGAAGGApⅡ’ACAATCACGAITTGCAACTGAATGACGGGACCGTCAAGGCCAGTTGCGTGGCAGGTTCC，r．rTAAAGTCATAGCACTTAATGTGGTCAGTAGGAGGTA丌TGGCGTCATTGCp江AAGAAGGCTTTACCCACTTCCGTGACATTCGAGCTCCTGTTCGACGGGACCAACCCAGDZQ-336CACTACCACCTGGAAAGAArACAGCCACGAI’TTGCAACTGAArGACGGGACCGTTAAGGCCA11TGCGTGGCAGGTTCCTrTAAGTCACAGCACl_I、AATGTGGTCAGTAGGAGGTAllTGGCArCA丌GCATAAGGGGGCTIvIACTCACTGCCGTGACAITCGAGCTCCTGTTCGACGGGACCAACCCAGDBJ．155CACCACCACTrGGAAAGAATACAACCATGGTIvrGCAGCTGGATGACGGGACTGTCAGGGCCATCTGCACTGCAGGGTCCTrTAAAGTL虹AGCGCll’AATGTGGTCAGCAGGAGGTACCTGGCATCCl7TACACAAGAGGGCTTTGCCCACCTCAGTAACArTTGAACTCCTf鲴rTTGATGGGACTAGTTCAr．Ⅲ·，4—一，．GDGM．317、’CACCACCACCTGGAAAGAATACAACCArGGllTGCAGCTGGATGACGGGACTGTCAGGGCCATCTGCACTGCAGGGTCCTl7TAAAGTT觚AGCGCTTA声汀GTGGTCAGCAGGAGGTACCTGGCATCArTACACAAGAGGGCTTTGCCCACCTCAGl：f气ACArTTGAACTCCTArTTGATGGGACTAGTCCAGDGY-4180 山东农业大学硕士学位论文TACCACCACCTGGAAAGAATACAGCCATGGTTTGCAGCTGGATGACGGGACTGTCAGGGCt钢rTrGCACTACAGGGTCCTrTAAAGrn蛆1AGCACTl’AATGTGGTCAGTAGGAGGl’ACCTAGCATCA丌ACACAAGAGGGCl’1TGCCCACCTCGGTAACArTCGAACTCCTATTCGATGGGACTAGTCCAGDJM．45CACCACCACTTGGAGAGAG仉虹AGGCATGGTlvrGCAGCTGGATGACGGGACTGTCAGGGCCATTTGCACTGCAGGGTCCTTTAAAGTTf气TAGCACTTAATGTGGTCAGCAGGAGGTACCTGGCATCA兀ACACAAGAGGGCl、TTGCCCACCTCAGTf气ACATTTGAACTCC丑钢rlvrGATGGGACTAGTCCAGDLC．176CACCACCACTTGGAGAGAGTf姐AGGCATGGTTTGCAGCTGGATGACGGGACTGTCAGGGCCArTTGCACTGCAGGGTCCr兀AAAGT，L蛆1AGCACrrAATGTGGlvI’AGCAGGAGGTACCTGGCATCArTACACAAGAGGGCl’1．TGCCCACCTCAGl：f气ACArTTGAACTCCTf蛔阿’TGArGGGACTAGTCCAGDLP．349CACCACCACCTGGGAAGAArATAACCATGGTTTGCAGCTGGATGACGGGACTGTCAGGGCCATTTGCACTGCAGGGTCCT，rTAAG1vI'ACAGCAClvI’AATGTGGTCAGTAGGAGGl’ACCTGGCATCArTACACAAGAGGGCT，rTACCCACCTCAGTAACAIv丌GAACTCTL钢nTGArGGGACTAGTCCAGDLS．50TACCACCACCTGGAAAGA觚ACAGCCATGGlvITGCAGCTGGATGACGGGACTGTCAGGGCTATTTGCACTACAGGGTCCTrTAAGT己蜘陵GCACTTAATGTGGTCAGTAGGAGGl’ACClAGCATC越兀1ACACAAGAGGGCTTTGCCCACCTCGGl：f～ACAITCGAACTCCTA订CGATGGGACTAGTCCAGDPY二189CACCACCACTTGGAGAGAGTf虹AGGCATGGTTrGCAGCTGGATGACGGGACTGTCAGGGCCAIvITGCACTGCAGGGTCCTIvI'AAAGTI：f钢队GCACll'AATGTGGTTAGCAGGAGGTACCTGGCATCAll．ACACAAGAGGGCTTTGCCCACCTCAGTf认CArTTGAACTCCTf钢?TTGAGGGGACTAGTCCA，GDPZ．148CACCACCACTTGGAAAGAATACAACCATGGll'TGCAGCTGGATGACGGGACTGTCAGGGCCATCTGCACTGCAGGGTCCT丌AAAGTn气TAGCGCTI’AATGTGGTCAGCAGGAGGTACCTGGCATCCllACACAAGAGGGCllTGCCCACCTCAGTf气ACArTTGAACTCCTf盯TTGArGGGACTAGTTCA8l 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查GDQX一44CACCACCACTTGGAGAGAG丑钢胍GGCATGGll’TGCAGCTGGATGACGGGACTGTCAGGGCCArTrGCACTGCAGGGTCCTTTAAAGTI’ATAGCACTTAATGTGGTCAGCAGGAGGTACCTGGCATCATTACACAAGAGGGCTTTGCCCACCTCAGllAACAITTGAACTCCTAmGATGG(认CTAGTCCAGDSH．206CACCACCACTTGGAAAGAATACAACCATGGTTTGCAGCTGGATGACGGGACTGTCAGGGCCATCTGCACTGCAGGGTCCT兀AAAGTL姐AGCGCTlAATGTGGTCAGCAGGAGGTACCTGGCATCCTTACACAAGAGGGCTTTGCCCACCTCAG眦CA丌TGAACTCCTATTTGATGGGACTAGTTCAGDSS．156CACCACCACTTGGAAAGAATACAACCATGGTTTGCAGCTGGATGACGGGACTGTCAGGGCCATCTGCACTGCAGGGTCCTllAAAGT仉气TAGCGCll'AATGTGGTCAGCAGGAGGTACCTGGCATCCTTACACAAGAGGGCTTTGCCCACCTCAGTf蚣CArrrGAACTCCTl钢阿’，rGATGGGACTAGTrCAGDSZ．126CACCACCACTTGGAGAGAGTf虹’AGGCATGGl、TTGCAGCTGGATGACGGGACTGTCAGGGCCAITTGCACTGCAGGGTCCT，rTAAAGT-L气TAGCACTrllAATGTGGTCAGCAGGAGGTACCTGGCATC册ACACAAGAGGGCTTTGCCCACCTCAGT久ACA_r，rTGAACTCC丑钢rTTGArGGGACTAGTCCAGDSZ-170CACCACCACTTGGAGAGAGTf鲴队GGCATGGT丌GCAGCTGGATGACGGGACTGTCAGGGCCAITTGCACTGCAGGGTCCT兀AAAGTL妞AGCACl_I’AATGTGGTrAGCAGGAGGTACCTGGCArCA兀ACACAAGAGGGCTTTGCCCACCTCAGTAACA兀_rGAACTCCTf蛔几TGATGGGACTAGTCCAGDTC．318CACCACCACCTGGAAAGApⅡ'ACAACCArGGllTGCAGCTGGATGACGGGACTGTCAGGGCCATCTGCACTGCAGG(Ⅺ℃CTTTAAGTⅣⅡ’AGCGCTTA肖-TGTGGTCAGCAGGAGGTACCTGGCATCATTACACAAGAGGGCl’1vrGCCCACCTCA(订’AACArTTGAACTCCTArTTGATGGGACTAGTCCAGDYC．173CACCACCACTTGGAGAGAGTATAGGCATGGl_I'TGCAGCTGGATGACGGGACTGTCAGGGCCAr]rTGCACTGCAGGGTCCTnAAAGrⅣ江'AGCACl’T．AATGTGGl’1’AGCAGGAGGTACCTGGCATCArTACACAAGAGGGCTTTGCCCACCTCAGTAACATTTGAAC82 山东农业大学硕士学位论文TCC丑钢阿’TGArGGGACTAGTCCAGDBL．24CACCACCAClvrGGAAAGAAI’ACAACCACGGCCTGCAGCTGGATGACGGGACTGTCAGGGCCArTTGCACTGCAGGGTCTTTCAAAGTTACAGCACTTAATGTGGTTAGTAGGAGGTACCTAGCATC疋rTACp汀'AAGAGGGCTTTGCCCACCTCAGTl’ACAITTGAACTCCTArTTGATGGGACCACCCCAGDDG一224CACTACCAClvrGGAAAGAATACAACCACGGCCTGCAGCTGGACGACGGGACCGTCAGGGCCArTTGCACTGCAGGGTClTTCAAAGTTACAGCACTrAATGTGGTTAGTAGGAGGTACCTAGCATCAnACAlAAGAGGGCl’TTGCCCACCTCAGlvIACAr，rTGAACTCCTArTTGATGGGACCACCCCAGDDHu-68CACCACCACTTGGAAAGAATACAACCACGGCCTGCAGCTGGATGACGGGACTGTTAGGGCCArTTGCACTGCAGGGTClTTCAAAGTTACAGCAClvI'A—汀GTGGTTAGTAGGAGGTACCTAGCATCArTACATAAGAGGGCl’TTGCCCACCTCAGTCACArTTGAACTCCTf鲴盯TGATGGGACCACCCCAGDGM．54CACTACCAClvrGGAAAGAp口ACAACCACGGCCTGCAGCTGGACGACGGGACC(订CAGGGCCAI]盯GCACTGCAGGGTClTTCAAAGTTACAGCACTrA—汀GTGGl_I’AGTAGGAGGTACCTAGCATCArTACATAAGAGGGClvITGCCCACCTCAGTl’ACArTTGAACTCCTf钢n’TGATGGGACCACCCCAGDGM．191CACl-～CCACTTGGAAAGAATACAACCACGGCCTGCAGCTGGACGACGGGACC(汀CAGGGCCAllTGCACTGCAGGGTClnTCAAAGTTACAGCACTI’AATGTGGll．AGTAGGAG(n’ACCTAGCATCAI]rACp旺AAGAGGGCTTTGCCCACCTCAGlvI’ACAIvrTGAACTCCTA丌TGATGGGACCACCCCAGDHD．27CACTACCACTTGGAAAGAArACAACCACGGCCTGCAGCTGGACGACGGGACCGTCAGGGCCArTTGCACTGCAGGGTCl’TTCAAAGl’TACAGCAClvIAATGTGGl、TAGTAGGAGGTACCTAGCATCAll’ACATAAGAGGGCTTTGCCCACCTCAGTTACAI’rITGAACTCC仉鲴nTGATGGGACCACCCCAGDHD．369CACCACCACTTGGAAAGApⅡ’ACAACCACGGCCTGCAGCTGGATGACGGGACTGTCAGGGCCAI’TTGCACTGCAGGGTCTTTCAAAGTTACAGCACl7TAATGTGGTI’AGTAG83 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查AAGGTACCTAGCArCA丌AC觚AAGAGGGCTTTGCCCACCTCAGTTACA_11TGAACTCCTArTTGATGGGACCACCCCAGDJM．431CACTACCACTTGGAAAGAp汀'ACAACCACGGCCTGCAGCTGGACGACGGGACCGTCAGGGCCArTrGCACTGCAGGGTCTITCAAAGTTACAGCACl_I’AATGTGGllAGTAGGAGGTACCTAGCATC芦J．TACp匹AAGAGGGClilvrGCCCACCTCAGTTACA丌TGAACTCCTArTTGATGGGACCACCCCAGDLP．293CACTACCACTTGGAAAGAATACAACCACGGCCTGCAGCTGGACGACGGGACCGTCAGGGCCAITTGCACTGCAGGGTCTTTCAAAGTI'ACAGCAClⅡA芦汀GTGGTllAGTAGGAGGTACCTAGCATCA丌rACATAAGAGGGCll’TGCCCACCTCAGll'ACArlvrGAACTCC丑钢几’TGATGGGACCACCCCAGDNB．396CACTACCACTTGGAAAGAATACAACCACGGCCTGCAGCTGGACGACGGGACCGTCAGGGCCAITTGCACTGCAGGGTCllTCAAAGl_IACAGCACll’AATGTGGl_I’AGTAGGAGGTACCTAGCATCAll’ACAI、AAGAGGGCTTTGCCCACCTCAGTTACA：rtTGAACTCCTf胡rTrGATGGGACCACCCCAGDNH．26CACTACCACTTGGAAAGA声正ACAACCACGGCCTGCAGCTGGACGACGGGACCGTCAGGGCCArTTGCACTGCAGGGTCl_I’TCAAAGl’TACAGCACl_I’AATGTGGlvIAGTAGGAGGTACCTAGCATCAI]队CATAAGAGGGCllTGCCCACCTCAGl’1、ACArTTGAACTCCTf蛔rTrGATGGGACCACCCCAGDQY-180CACTACCACTTGGAAAGAAI’ACAACCACGGCCTGCAGCTGGACGACGGGACCGTCAGGGCCArTTGCACTGCAGGGTCTTTCAAAGTTACAGCACTTAp汀GTGGTTAGTAGGAGGl’ACCTAGCATCArTAC久IAAGAGGGCTTTGCCCACCTCAGTTACAn盯GAACTCCTAr丌GATGGGACCACCCCAGDQY-255CACTACCACTTGGAAAGAATACAACCACGGCCTGCAGCTGGACGACGGGACCGTCAGGGCCArT，rGCACTGCAGGGTCl’，rTCAAAGTTACAGCAC丌AATGTGGlvIAGTAGGAGGTACCTAGCATCA几ACA=rAAGAGGGCl、TTGCCCACCTCAGlvIACArTTGAACTCCTAI‘TTGATGGGACCACCCCAGDQY-298CACTACCACTTGGAAAGAATACAACCACGGCCTGCAGCTGGACGACGGGACCGTC84 山东农业大学硕士学位论文AGGGCCA丌TGCACTGCAGGGTCTTTCAAAGTTACAGCAC订AATGTGGl’1’AGTAGGAGGTACCTAGCATCATTACpJ’AAGAGGGCTTTGCCCACCTCAGTl’ACATTTGAACTCCTATTTGATGGGACCACCCCAGDSG．70CACTACCACTTGGAAAGA觚ACAACCACGGCCTGCAGCTGGACGACGGGACCGTCAGGGCCATTTGCACTGCAGGGTCTTTCAAAGl’1’ACAGCAC兀AATGTGGTTAGTAGGAGGl、ACCTAGCATCArTACpdAAGAGGGCllTGCCCACCTCAGTTACArTTGAACTCCTATTTGATGGGACCACCCCAGDShS．25CACTACCACTTGGAAAGAATACAACCACGGCCTGCAGCTGGACGACGGGACCGTCAGGGCCArTTGCACTGCAGGGTCTTTCAAAGT，IACAGCACmATGTGGTTAGTAGGAGGTACCTAGCATCArTACAI：AAGAGGGCTTTGCCCACCTCAGTTACArTTGAACTCCTATTTGATGGGACCACCCCAGDSJ．30CACTACCACTTGGAAAGA—江’ACAACCACGGCCTGCAGCTGGACGACGGGACCGTCAGGGCCArTTGCACTGCAGGGTCTTTCAAAGTl’ACAGCAr，]几’AATGTGGl’TAGTAGGAGGTACCTAGCATCArTAC—Ⅱ'AAGAGGGCl_rTGCCCACCTCAGTTACATTTGAACTCCTAmGATGGGACCACCCCAGDSS一55CACTACCACTTGGAAAGAATACAACCACGGCCTGCAGCTGGACGACGGGACCGTCAGGGCCArTTGCACTGCAGGGTCTTrCAAAGTI’ACAGCACl_I’AATGTGGTTAGTAGGAGGTACCTAGCATCATTACATAAGA．GGGCTTTGCCCACCTCAGTTACATtTG·AACTCCTArTTGATGGGACCACCCCA。GDSS．311CACTACCACTTGGAAAGAp正ACAACCACGGCCTGCAGCTGGACGACGGGACCGTCAGGGCCAITTGCACTGCAGGGTCTTTCAAAGTTACAGCACllAATGTGGTTAGTAGGAGGTACCTAGCATCAnACAI：AAGAGGGCTTTGCCCACCTCAGTTACArTTGAACTCCTf钢_1’TGATGGGACCACCCCAGDSS．315CACTACCACTTGGAAAGAATACAACCACGGCCTGCAGCTGGACGACGGGACCGTCAGGGCCA丌TGCACTGCAGGGTCTTrCAAAGTTACAGCACTTAATGTGGTTAGTAGGAGGTACCTAGCATCArr]队CAIAAGAGGGCTTTGCCCACCTCAGTlACArTTGAACTCCTf蜘rTTGArGGGACCACCCCAGDSZ．5285 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查CAC7I’ACCACTTGGAAAGAATACAACCACGGCCTGCAGCTGGACGACGGGACCGTCAGGGCCAITTGCACTGCAGGGTCTTTCAAAGTrIACAGCACl_I、AATGTGGTTAGTAGGAGG7I’ACCTAGCATCArTACpd'AAGAGGGCl、TTGCCCACCTCAGlvI’ACATTTGAACTCCl：ATTTGATGGGACCACCCCAGDSZ一53CAC7I'ACCACTTGGAAAGAA1’ACAACCACGGCCTGCAGCTGGACGACGGGACCGTCAGGGCCAI’TTGCACTGCAGGGTCTTTCAAAGTTACAGCACTTAATGTGGrI’AGTAGGAGGTACCTAGCATCAnAC—d'AAGAGGGClTTGCCCACCTCAGTTACATTTGAACTCCT越rTTGATGGGACCACCCCAGDSZ．64CACTACCACTTGGAAAGAATACAACCACGGCCTGCAGCTGGACGACGGGACCGTCAGGGCCA丌TGCACTGCAGGGTCTTTCAAAGTl’ACAGCACl、TAATGTGGTTAGTAGGAGGl-～CCTAGCATCATTAC芦I=I’AAGAGGGCll’TGCCCACCTCAGTTACATTTGAACTCCTAmGATGGGACCACCCCAGDSZ．185CACTACCACTTGGAAAGA觚ACAACCACGGCCTGCAGCTGGACGACGGGACCGTCAGGGCCArTTGCACTGCAGGGTCTTTCAAAGTl’ACAGCACTTAATGTGGl’1’AGTAGGAGGTACCTAGCATCAr，：隋CAl’AAGAGGGCl_11，rGCCCACCTCAGlvIACArTTGAACTCCTAllTGArGGGACCACCCCAGDXQ-60CACTACCACTTGGAAAGAATACAACCACGGCCTGCAGCTGGACGACGGGACCGTCAGGGCCArTTGCACTGCAGGGTCTTTCAAAGTTACAGCACTTAATGTGGl’1’AGTAGGAGGTACCTAGCATCA丌ACpⅡ’AAGAGGGCTTTGCCCACCTCAGTTACAT，丌GAACTCCTArTTGATGGGACCACCCCAGDXQ--61CACTACCACTTGGAAAGAATACAACCACGGCCTGCAGCTGGACGACGGGACCGTCAGGGCCAIvITGCACTGCAGGGTCl7TTCAAAGTI’ACAGCACTI’AATGTGGTTAGTAGGAGGTACCTAGCATCArTACAI：AAGAGGGCT，丌GCCCACCTCAGTTACAI’TTGAACTCCTf钢rTTGArGGGACCACCCCAGDXX．225CACTACCACTTGGAAAGAATACAACCACGGCCTGCAGCTGGACGACGGGACCGTCAGGGCCA：r．丌GCACTGCAGGGTCTTTCAAAGTTACAGCACTTAATGTGGTTAGTAGGAGGTACCTAGCATCATTACATAAGAGGGCTTTGCCCACCTCAGTTACATTTGAACTCCTf朝1TGATGGGACCACCCCA86 山东农业大学硕士学位论文GDXX一292CAC7I’ACCACTTGGAAAGAArACAACCACGGCCTGCAGCTGGACGACGGGACCGTCAGGGCCArTTGCACTGCAGGGTCTTTCAAAGTTACAGCAC兀AATGTGGTTAGTAGGAGGl-～CCTAGCATCArTACAIAAGAGGGCllTGCCCACCTCAGTTACAITTGAACTCCTAllTGATGGGACCACCCCAGDXX一312CACTACCACTTGGAAAGAArlACAACCACGGCCTGCAGCTGGACGACGGGACCGTCAGGGCCArTTGCACTGCAGGGTCllTCAAAGl、1’ACAGCAC丌AATGTGGl’TAGTAGGAGGlACCl、AGCATCA兀ACATAAGAGGGCTTTGCCCACCTCAGTl’ACArlvrGAACTCCTATTTGATGGGACCACCCCAGDZC一67CACCACCACTTGGAAAGAp汀ACAACCACGGCCTGCAGCTGGATGACGGGACTGTTAGGGCC久I’TTGCACTGCAGGGTCTTTCAAAGTTACAGCACTlAATGTGGTTAGTAGGAGGTACCTAGCATCAll’AC／气TAAGAGGGCTTTGCCCACCTCAGTCACAr丌GAACTCC卫蜘_I’TGATGGGACCACCCCAGDZC一294CACTACCACTrGGAAAGAp灯’ACAACCACGGCCTGCAGCTGGACGACGGGACCGTCAGGGCCArlvrGCACTGCAGGGTCTTTCAGTl’ACAGCACTTAp汀GTGGTTAGTAGGAGGl’ACCTAGCATCArTACpd’AAGAGGGCTTTGCCCACCTCAGTTAC久r]盯GAACTCC，I：l钢盯TGArGGGACCACCCCAGDNH．19CACTACCACCTGGAAAGAATACAACCArGGTrTACAGCTGGArGACGGGACTGTC’』AGGGCCACT瑚ACTGCAGGGTCCTrTAAAGTL气TAGCACT，I’AATGTGGT-I’AGTAGGAGGTACCTGGCATCAnACACAAGAGGGCT兀GCCCACCTCA(n’AACArTTGAACTCCTf钢甩TGATGGGACCAGCCCAGDSllD．12CACTACCACCTGGAAAGAATACAACCATGGT，rTACAGTTGGATGACGGGACTGTCAGGGCCACTTGCACTGCAGGGTCCTrTAAAGTL蛔队GCACTTAATGTGGTTAGTAGGAGGTACCTGGCATCAI’TACACAAGAGGGCTTTGCCCACCTCAGTAACArllTGAACTCCTAr，rTGATGGGACCAGCCCAGDSZ．18CACTACCACCTGGAAAGAATACAACCATGGT丌ACAGCTGGArGACGGGACTGTCAGGGCCACTTGCACTGCAGGGTCCTIvr'AAGTL姐AGCACTTAATGTGGTI’AGTAGGAGGTACCTGGCATCArTACACAAGAGGGCl_I’TGCCCACCTCAGTAACAITTGAAC87 广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查TCCTATTTGATGGGACCAGCCCAGDSZ．291CACTACCACCTGGAAAGAATACAACCATGGTTl’ACAGCTGGATGACGGGACTGTCAGGGCCACTTGCACTGCAGGGTCCTI兀AAAGTJL气1’AGCACrI’AATGTGGTTAGTAGGAGGTACCTGGCATCA丌rACACAAGAGGGCTTTGCCCACCTCAG瞰CATTTGAACTCCTI簟门阿GATGGGACCAGCCCAGDXQ一140CACTACCACCTGGAAAGApd'ACAACCArGGTTTACAGTrGGATGACGGGACTGTCAGGGCCACTTGCACTGCAGGGTCCTTTAAAGT，L气TAGCACTTAATGTGGTTAGTAGGAGGTACCTGGCATCA．I’1IACACAAGAGGGCTTTGCCCACCTCAGTAACATTTGAACTCCL蜩『ITGATGGGACCAGCCCAGDZS．143CACTACCACCTGGAAAGAp(rACAACCATGGTll'ACAGTrGGATGACGGGACTGTCAGGGCCACTTGCACTGCAGGGTCCT兀AAAGTL鲴睑GCACTTAATGTGGl、TAGTAGGAGGTACCTGGCATC久rTACACAAGAGGGCTI’TGCCCACCTCAGTAACArTTGAACTCCTf鲴几’TGATGGGACCAGCCCA 山东农业大学硕士学位论文本研究测得16株CSFV流行毒株E2全基因序列信息：GDZC．343CGGCTAGCCTGCAAGGAAGArTACAGGl’ACGCAArATCGTCAACCGATGAGAI’AGGGCTACTTGGGGCCGGAGGTCTCACCACCACCTGGAAGGAATACAATCACGArTTGCAACTGAATGACGGGACCGTCAAGGCCAGTTGCGTGGCAGGTTCCrnAAAGTCATAGCACTTAATGTGGTCAGTAGGAGGTf蛔仃TGGCGTCArTGCAI’AAGAAGGCTrI”I’ACCCACTTCCGTGACArTCGAGCTCCTGTTCGACGGGACCAACCCATCAACTGAGGAp汀GGGAGATGACTTCAGGTCCGGGCTGTGCCCGlvITGACACGAGTCCTGTTGTTAAGGGAAAGTACAp江ACGACCTTGTTGAACGGTAGTGCl7TTCl’ArCTTGTCTGCCCAATAGGGTGGACGGGTGTCAI'AGAGTGCACAGCAGTGAGCCCAACAACTCTGAGGACAGAAGTGGTAAGACCTTCAGGAGAGACAAGCCCTTTCCGCACAGAATG(讼TTGTGTGACCACCACAGTGGAAATGAAGAr]门1A兀CTf盯TGTAAGTTGGGGGGCAACTGGACATGTGTGAAAGGCGAGCCAGTGGTCTACACAGGGGGGGTAGTAAAACAATGTAGATGGTGTGGCTTCGACTTCGATGGGCCTGACGGACTCCCGCAnACCCCATAGG眦GTGCAI]【’TTGGCAAATGAGACAGGTTACAGApI=rAGTAGArTCAACGGACTGTf气ACAGAGATGGCGTTGTAATCAGCACAGAGGGGAGTCATGAGTGCTTGATCGGTAACACGACTGTCAAGGTGCATGCATCAGATGAAGACTGGGCCCl肖rGCCATGCAGACCTAAAGAGATTGTCTCTAGTGCTG(汀CCTGTAAAGAAAACCTCCTGTACATTCAACTACACAAAAACl丌TGAAGAACAGGTACTATGAGCCCAGGGACAGCTACTTCCAGCAAD蛆ArGCl_I’AAGGGTGAGTATCAGTACTGGT丌GACCTGGArGCGACTGACCGCCACTCAG疋门ACTTCGCAGA忿rlvrGTC(汀C1_rGGTGGTGGl’AGCACTGTl’AGGAGGAAG疋EATGTCCTGTGGCTGArAGTGACCl、ACGl’AGTTCl：f气ACAGAACAACTCGCCGCTGGTGDGM．317CGGTTGTCCTG眦GGAAGACl、ACAGGTATGCAAn气TCATCAACCAATGAGATAGGGCCACTAGGAGCTGAAGACCTCACCACCACCTGGAAAGAATACAACCATGGl’TTGCAGCTGGATGACGGGACTGTCAGGGCCATCTGCACTGCAGGGTCCTll'AAAGTB气TAGCGCl_I’AATGTGGTCAGCAGGAGGTACCTGGCATCA，r]队CACAAGAGGGCl’TTGCCCACCTCAGl=AACArTTGAACTCCTK【’TTGATGGGACTAGTCCAGCA(订TGAGGAGATGGGAGATGACTTTGGGTTTGGGCTGTGCCCTTTTGACACAACCCCTGTGGTCAAAGGGAAGTACAACACTACTTTAll'AAACGGTAGTGCTTTCTACCTAGTCTGCCCGATAGGGTGGACGGGTGTCAI'AGAGTGCACGGCAGTf气AGCCCCACAACCTTGAGAACGGAAGTGGTGAAGACCTTCAAGAGAGAGAAGCCTITCCCACACAGAGTGGA：rrGCGTGACCACTI鲴噙GTGGAAAAAGAAGACCTGTTCTACTGCAAGCTGGGGGGCAAT89 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山东农业大学硕士学位论文CGGCTGTCCTGTAAGGAAGACTACAGGl认TGCGArATCATCAACCAATGAGATAGGGCCGCTAGGGGCTGAAGGTCTCACCACCACTTGGAGAGAG，rf虹AGGCATGGTTTGCAGCTGGATGACGGGACTGTCAGGGCCATTTGCACTGCAGGGTCCTTTAAAGTTATAGCACTTAATGTGGTCAGCAGGAGGl、ACCTGGCATCArTACACAAGAGGGClvrTGCCCACCTCAGTAACAn门?GAACTCCTf钢rTrGArGGGACTAGTCCArCGArTGAGGAGATGGGAGATGACl兀’TGGAI’TTGGGCTGTGCCCrllTGACACAACCCCAGTGGTAAAAGGGAAGTACApⅡ'ACCACTCTArrAAACGGTAGTGCTTTCl隗CCTAGTCTGCCCAATAGGATGGACGGGTGTCAI’AGAGTGCACAGCAG眦GCCCTACAACCTTGAGAACAGAAGTGGTGAAGACCTTCAAGAGAGAGAAGCCTTTCCCACACAGAGTGGGTTGCGTGACCACTf蛆AGTAGAGAAAGAAGACCTGTTCTACTGCAAGTGGGGGGGTAATTGGACArGTGTGAAAGGCAACCCGGTGACCTACATGGGGGGGCAAGTAAAACAATGCAAGTGGTGTGGTn【’TGACTTCAAGGAGCCCGATGGGCTCCCACACl’ACCCCATAGGCAAGTGCATCCTAGCAAATGAGACGGGTTACAGGGTAGTGGA订CCACAGACTGCAATAGAGATGGCGTTGTrATCAGCACTGAAGGGGAACACGAGTGCTTGA订GGCAACACCACCGTCAAGGTGCACGCGTTGGArGGAAGACTGGGCCCTATGCCATGCAGACCCAAAGAAATCGTCTCTAGTGCGGGACCTGl：f气AGGAAAACTTCCTGTACl’TTCAArTACACAAAGACACTAAAAAACAAGTACTATGAGCCCAGGGACAGCTf玎TTTCAGCAArf鲴险TGCTTAAGGGCGAGTACCAATACTGGTTTGACCTGGACGCGACTGACCACCACACAGACl’ACTTCGCCGAArTTGTTGTCTTGGTGGTAGTGGCACTf钢陌GGGTGGGAGGTACGTCCTGTGGCTA—d’AGTGACCTArf气TAGTTCTAACAGAGCAACTTGCTGCCGGTGDLC．176CGGCTGTCCTGTf姐GGAAGACTACAGGTATGCGArATCArCAACCAATGAGATAGGGCCGCTAGGGGCTGAAGGTCTCACCACCACTTGGAGAGAGTATAGGCATGGTTrGCAGCTGGATGACGGGACTGTCAGGGCCATTTGCACTGCAGGGTCCTTTAAAGTTATAGCACTTAATGTGGTTAGCAGGAGGTACCTGGCATCArTACACAAGAGGGCTTTGCCCACCTCAGTf气ACAI’TrGAACTCCTI鲴n’TGArGGGACTAGTCCAGCGATTGAGGAGATGGGAGATGACTTTGGArTTGGGCTGTGCCCTTTTGACACAACCCCAGTG-G江．AAAGGGAAGTACAArACCACTCTArTAAACGGTAGTGCTTTCTACCTAGTCTGCCCAATAGGATGGACGGGTGTCAIAGAGTGCACAGCAGT从GCCCTACAACCTTGAGAACAGAAGTGGTGAAGACCTTCAAGAGAGAGAAGCCTTTCCCACACAGAGTG(讼TTGCGTGACCACTf鲴陵GTAGAGAAAGAAGACCTGTTCTACTGCAAGTGGGGGG(、1AA订GGACATGTGTGAAAGGCAACCCGGTGACCTACATGGGGGGGCAA(H'AAACAArGCAAGTGGTGTGGTTTTGACTTCAAGGAGCCC(孔气TGGGCTCCCACACTACCCCATAG91 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山东农业大学硕士学位论文CAGCTGGATGACGGGACTGTCAGGGCCATCTGCACTGCAGGGTCCTTTAAAGTI'ATAGCGCTTAATGTGGTCAGCAGGAGGTACCTGGCATCCTTACACAAGAGGGCTTTGCCCACCTCAGmCA丌TGAACTCCTA丌TGATGGGACTAGTTCAGCAGTTGAGGAGATGGGAGATGACTTTGTGTTTGGGCTGTGCCCrrTTGACACAACCCCTGTGGTCAAAGGGAAGTACAACACTACTrr瞄I=]【’TAAACGGTAGTGCTTTCTACCTAGTCTGCCCGAI’AGGGTGGACGGGTGTCATAGAGTGCACGGCAGTAAGCCCCACAACCTTGAGAACGGAAGTGGTGAAGACCTTCAAGAGAGAGAAGCCTTTCCCACACAGAGTGGArTGCGTGACCACTf虹AGTGGAAAAAGAAGACCTGTTCTACTGCAAGCTGGGGGGCAATTGGACATGTGTGAAAGGTAACCCGGTGACCTACAI’AGGGGGGCAAGTAAACAATGCAGGTGGTGCGG，r，ITTGACTTCAAGGAGCCCGATGGGCTCCCGCACTACCCCATAGGCAAGTGCArCTTAGCl’AATGAGACAGGTllACAGGGTAGTGGATTCCACAGACTGTAACAGAGATGGCGTCGTI：ATCAGTACTGAAGGAGAACACGAGTGCTrGA订GGCAGCACCACCGTTAAGGTGCGCGCGTTGGATGGGAGACTGGGCCCTATGCCGTGCAGACCCAAAGAAATCGTCTCTAGTGCGGGACCTGTAAGGAAAACTTCTTGCACTTTCAAll’ACACAAAGACAC融GAAACAAGTACl：ATGAGCCCAGGGAI’AGCTArTrCCAGCA—Ⅱ’ACATGCTl’AAGGGCGAGl：ACCAAn盯TGGTTTGATCTGGACGTGACTGACCACCACACGGACl’ACTTTGCCGAATTCGTTGTCTTGGTGGTAGTGGCACTACTAGGGGGGAGGTACGTTCTGTGGCTA觚AGTGACCTAL气TAGTTCT久ACAGAGCAACTCGCTGCCGGTGDTC．318CGGTTGTCCTGTAAGGAAGACTACAGGTATGCAATATCATCAACCAATGAGA工AGGGCCACTAGGAGCTGAAGACCTCACCACCACCTGGAAAGAAI’ACAACCATGGTTTGCAGCTGGATGACGGGACTGTCAGGGCCATCTGCACTGCAGGGTCCT．rTAAAGT，I：f气TAGCGCTI’AATGTGGTCAGCAGGAGGTACCTGGCATCArTACACAAGAGGGCl7TTGCCCACCTCAGTAACAI、TTGAACTCCTArTTGATGGGACTAGTCCAGCAGTTGAGGAGATGGGAG-虹GACTTTGGGTTTGGGCTGTGCCCTTTTGACACAACCCCTGTGGTCAAAGGGAAGTACAACACl’ACTrn隋I兀AAACGGl’AGTGClTTCl’ACCl’A(汀CTGCCCGATAGGGTGGACGGGTGTCAI’AGAGTGCACGGCA(托AAGCCCCACAACCTTGAGAACGGAAGTGGTGAAGACCTTCAAGAGAGAGAAGCCl、TTCCCACACAGAGTGGA盯GCGTGACCACTf妞AGTGGAAAGAAGACCTGTTCTACTGCAAGCTGGGGGGCAATTGGACATGTGTGAAAGGTAACCCGGTGACCTACATAGGGGGGCAAGTAAAACA．ATGCAGGTGGTGCGGTTTTGACTTTAAGGAGCCCGATGGGCTCCCGCACTACCCCATAGGCAAGTGCATC盯AGCTAATGAGACAGGTTACAGG(n’AGTG(讼TTCCACAGACTGTf气ACAGAGATGGCGTCGTrATCAGTACTGAAGGAGAACACGAGTGCTTGArTGGC93 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