我国部分地区羊梨形虫病pcr检测方法建立及分子流行病学调查

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1、河南农业大学硕士学位论文我国部分地区羊梨形虫病PCR检测方法建立及分子流行病学调查姓名：朱丹申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：宁长申201206河南农业大学2012届硕士研究生学位论文摘要羊寄生虫病是对养羊业造成严重影响的疾病之一，羊在感染寄生虫后，生长发育缓慢，饲料报酬降低，降低了羊的产肉量和产奶量。有的疾病可使怀孕母羊流产或早产，受胎率降低，羔羊成活率F降，严重者可导致死亡，导致养殖成本增加，经济价值1-1绛-。梨形虫病(泰勒虫病和巴贝斯虫病)是寄生于脊椎动物红细胞或者其他细胞内的蜱传性寄生虫病，可导致山羊、绵羊发热、贫血、消瘦、黄疸、血红蛋白尿等症状，严重

2、者可导致死亡，常给养羊业造成巨人经济损火，严重制约养羊业的发展。此外，由无该病地区引进的羊对梨形虫极为敏感，发病率和jf，匕亡率均较高。冈此，该病也严重阻碍着优良品种的引进雨1地方晶种改良I：作。据报道，II_}：界许多国家和地区都发生过梨形虫病。从2011年1月到2012年2月，应用多种检奄方法对从我国部分地区采集的1043份粪便样品，进行了山羊肠道寄生虫感染情况调查。期问，对我国部分地区的羊梨形虫病进行调查，并进行了基丁．18SrRNA基冈的PCR方法对lj¨JI生样品进行了种类鉴定和种系发育分析。1．为了解我国部分地区山羊肠道寄生虫感染情况，对山羊肠道寄生虫病的防治

3、提供参考依据。丁．2011年1月到2012年2月，应川离心沉淀法、卢戈氏碘液染色法、饱蔗糖溶液漂浮法和麦克马斯特计数法等多种检查方法对河南省部分地区，安徽合肥，重庆云冈I、青海鄂陵湖、内蒙古呼利浩特等11个县市的1043份山羊粪便样晶进行采集与检测。结果共检测剑球虫、隐孢子虫、贾第虫、阿米巴、鞭虫、细颈线虫、其他线虫、莫尼茨绦虫、矛形双腔吸虫等9种(类)寄生虫，总感染率为95．9％。多早混合感染，最多可同时感染6种，以混合感染2种寄生虫和3种寄生虫居多，感染率分别为30．3％和31．7％。其中球虫为优势感染虫种，感染率达到90．8％，矛形双腔吸虫感染率最低，仅为0．67％

4、；不同季1，羊贾第虫感染率存在显著的差异，夏季感染率(11．1％)高丁．春季(4．72％)祠I秋季(5．41％)；隐孢子虫感染见丁春、秋和冬季，秋季感染率(4．63％)显著高丁I春季和冬季，而且幼龄羊的隐孢子虫感染率(3．77％)高丁．成年羊感染率(0．16％)，舍饲羊群隐孢子虫感染率(1．58％)略高丁．放牧羊群(1．47％)。结果表明山羊肠道寄生虫感染较为普遍和严重，并携带人兽共患寄生虫，应加强其肠道寄生虫病的综合防治。2．为查明我国部分地区感染羊的巴贝斯虫、泰勒虫的种类及分子流行病学特征，为制定有效防治措施提供依据。于2011年4月到2011年12月，根据河南省的不

5、同地域和饲养方式，选取河南省的郑州市、中牟县、登封市、信阳市商城县、三门峡市(灵宝市、卢氏县)、安fj¨市以及辽。j：省朝刚市、山东省临胸市等11个县市，共采集血．液样品212份。采刚传统的姬姆萨染色法和PCR检测方法(常规PCR和巢式PCR)对样品进行检测。姬姆萨染色检查，检查到的附

6、生样品有21份，感染率为9．90％(21／212)，PCR方法检测，检测到⋯性样品有46份，感染率为21．7％(46／212)；利用吕氏泰勒虫特异性引物扩增证明，所得到的刚性样品均为吕氏泰勒虫。对采集的硬蜱进行种类鉴定，均为长角血蜱。这次调查末发现巴贝斯虫。结果表明，PCR检测方法比传统的

7、姬姆萨染色镜检方法要敏感、特异。所得到的泰勒虫阳性第1页共57页河南农业大学2012届硕士研究生学位论文样品经鉴定均为吕氏泰勒虫3．为确定我国部分地区羊泰勒虫分离株的种类，对18SrRNA序列扩增出的46个羊泰勒虫分离株序列在NCBI中Blasl比对，然后搜索相关核酸序列用ClustalX1．83软4'1二进行序列比对，用DNAStar4．0软件进行同源序列分析，应用ClustalX1．83和Phylip3．64等生物学软件对序列进行比对并构建分子进化树。结果：Blast比对和I同源性分析时，基丁．18SrRNA基因的46个泰勒虫分离株与Theilerialuwenshu

8、ni(JF71983】．】)、Theileriasp．SZH-sheep(HQ844674．】)同源性为100％；在建立的系统发育树上，所得到的46株分离株与T．1uwenshuni(JF719831．1)利Theileriasp．SZH—sheep(HQ844674．1)在同一分支上。结果证明，所分离到的泰勒虫均为吕氏泰勒虫(T．1uwenshuni)。关键词：羊；梨形虫；泰勒虫；巴贝斯虫；流行病学调查；18SrRNA基因；PCR：同源性分析；种系发育分析第2页共57页河南农业大学2012届硕士研究生学位论文Developm