凝胶层析与离子交换层析结合法纯化地鼠肾细胞狂犬病疫苗

《凝胶层析与离子交换层析结合法纯化地鼠肾细胞狂犬病疫苗》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

凝胶层析与离子交换层析结合法纯化地鼠肾细胞狂犬病疫苗Purificationofhamsterkidneycellrabiesvaccinebygelandionexchangechromatography作者姓名：杨莲花领域（方向）：制药工程指导教师：王毅教授类别：工程硕士答辩日期：2015年6月6日 前言分离纯化是现代生物技术药物制造工艺的核心，是决定产品的安全和成本的技术基础。随着2010版《中国药典》对人用地鼠肾细胞狂犬病疫苗中蛋白含量标准的提高，分离纯化技术再一次成为生物药企着重研究的对象。本论文围绕着凝胶层析和离子交换层析组合使用的方法展开，本人所在的纯化组对层析柱的使用进行了长期跟踪实验，将两种层析柱以三种方式组合纯化实验样品，通过对最终纯化液的检定，确定适用于生产的较优的组合方式。层析柱的使用在生物医药领域也是一个热门研究的课题，各个实验也有着不同的论点，本实验依托着药企自身特点和生产需要展开，只是沧海一粟，其中难免有不当或疏漏之处，请各位老师及同行前辈批评指正，以求完善。I 凝胶层析与离子交换层析结合法纯化地鼠肾细胞狂犬病疫苗摘要：2010版《中国药典》中人用狂犬病疫苗中的蛋白含量标准提高，要求纯化后未加稳定剂的病毒液中总蛋白含量不高于80µg/剂，牛血清蛋白残留应不高于50ng/剂，成品中宿主细胞蛋白残留不高于24µg/剂，提高纯化分离效果则是生物药企要攻克的问题之一。长期以来在层析系统应用的摸索实验中显示，凝胶层析（Speharose4FastFlow，4FF）对宿主蛋白和牛血清蛋白分离效果较好，工作条件温和，但实际生产应用中由于样品杂质含量高，容易将层析柱进液口及凝胶孔径堵塞，延长分离时间而影响分离效果；离子交换层析(Core700)，分辨率高，胶体积小，清洗方便，上样量大，分离时间短，在生物医药等领域得到广泛应用。本次实验将凝胶层析与离子交换层析按照core700-core700-4FF，Core700-4FF-4FF，Core700-4FF-Core700三种不同顺序组合使用，对实验样品进行纯化分离。本实验分为两部分：第一部分，选取3批实验样品，每批样品均按上述三种组合方法进行纯化分离，根据纯化后的总蛋白含量，宿主蛋白含量，牛血清蛋白含量，抗原含量，确定能达到药典标准的组合方式。经实验1得到，两种层析柱以Core700-4FF-4FF的组合方式使用时，分离效果较优于其他两种组合方式。第二部分，根据实验1的结果，将另外3批实验样品按照Core700-4FF-4FF的组合方法进行验证实验，检测最后纯化液的总蛋白含量、宿主蛋白含量、牛血清蛋白含量、抗原含量。通过两部分实验，两种层析柱以Core700-4FF-4FF的组合方式使用时，纯化后的检测结果符合2010版药典的要求，可以作为建立纯化工艺的参考，II 也可作为各相关技术人员操作及实验参考。层析系统在疫苗纯化中的应用研究一直是个备受关注课题，上样体积、上样速度、上样浓度和抗原收集起止点的选择，都是影响疫苗纯化效果的因素，而凝胶层析柱与离子交换层析柱的组合方式更好地发挥了两种层析柱的特点，优化了疫苗的纯化效果，生物药企可根据生产情况，合理灵活使用两种层析柱，保证疫苗质量，提高纯化效率，增加企业的经济效益。关键词：凝胶层析，离子交换层析，纯化，狂犬病疫苗III PurificationofhamsterkidneycellrabiesvaccinebygelandionexchangechromatographyAbstract：ThestandardofhumanrabiesvaccineproteincontenthasbeenraisedinChinesePharmacopoeia2010edition.Itrequirespurifiedtotalproteincontentandbovineserumproteinresiduescontentnohigherthan80μg/agentand50ng/agent.Beforeaddingstabilizerintovaccine,theresidualhostcellproteinofendproductsrequirenomorethan24μg/agent.Improvetheseparationandpurificationeffecthasalwaysbeenoneoftheproblemstobeovercomeforbio-pharmaceuticalcompanies.Wehavelearntfromthelong-termexplorationexperimentsofapplicationinchromatographysystemthat:GelChromatographycolumn(Sepharose4FastFlow,4FF)providesgoodseparationabilityforthehostproteinandbovineserumproteinwithmildoperatingconditions.However,duetothehighimpuritycontentofsamples,itiseasytoblockliquidinletduringactualproductionapplications,andwouldprolongseparationtimeandinfluenceseparationability.IonExchangeChromatography(Core700)whichcontainsalltheabilityofhighsensitivity,smallsize,easytoclean,heavyworkload,andshortseparationtime,widelyusedinthefieldofBio-medicineandotherfields.Thispaperchoosesachapteroffumbleexperiment,combinetheGelFiltrationandIonExchangeChromatographywiththreedifferentsequences:Core700-Core700-4FF,Core700-4FF-4FFandCore700-4FF-Core700,toseparateandpurifyexperimentalsamples.Theexperimentwasdividedintotwoparts:thefirstpart,selectthreebatchesofexperimentalsamples,thenpurifyandisolateeachbatchofsamplesaccordingtothethreeabove-mentionedcombinationmethods.Dependingonthecontentoftotalprotein,hostprotein,bovineserumprotein,andantigen,selectthecombinationmethodwhichachieveChinesePharmacopoeiastandard.Theexperimental1showswhenusedincombinationmethodCore700-4FF-4FF,separationIV effectisrelativelyhigherthanothermethods.Thesecondpart:basedonresultsofexperiment1,useotherthreebatchesofexperimentalsamplestodovalidationtestaccordingtothecombinationmethoddescribedabove,testthecontentoffinalpurifiedsolution’stotalprotein,hostprotein,bovineserumproteinandantigen.Thistwo-partexperimentshowsundercombinationmethodCore700-4FF-4FFuse,thedetectionresultofpurifiedsamplesmeetstherequirementsofChinesePharmacopoeia2010edition.Itcanbeconsideredasareferenceofestablishmentofpurificationprocess,andmayalsobeusedasareferenceofoperationandexperimentforrelevanttechnicalpersonnel.Applicationresearchinvaccinepurificationwithchromatographysystemhasbeenasubjectofconcern,allofthisfactorsinfluencevaccinepurificationeffectwhichincludesamplevolume,loadingrate,sampleconcentration,andthestartingandendingpointsofcollection.ThejointuseofGelFiltrationChromatographyandIonExchangeChromatographyprovideabetterwaytoplaythecharacteristicsoftwochromatographycolumn,andoptimizepurificationeffectofthevaccine.Accordingtodifferentconditions,bio-pharmaceuticalcompaniescanuseCore700and4FFinareasonableandflexiblewaytoensurevaccinequality,improvetheefficiencyofpurificationandincreaseeconomicefficiencyforenterprises.Keywords：gelchromatography，ionexchangechromatography，purification，rabiesvaccineV 目录第1章绪论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1第2章实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯62.1实验试剂及仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯62.2样品制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯62.3样品纯化及检定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯9第3章结论与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯193.1结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯193.2讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯19参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯24作者简介及科研成果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯26致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯27VI 第1章绪论疫苗主要是由具有免疫保护性的抗原如蛋白、多肽、多糖或核酸等与免疫佐剂混合制备而成。其作用原理是当机体通过注射或口服等途径接种疫苗后，疫苗中的抗原分子就会发挥免疫原性作用，刺激机体免疫系统产生高效价特异性的免疫保护物质，如特异性抗体、免疫细胞及细胞因子等，当机体再次接触到相同病原菌抗原时，机体的免疫体统便会依循其免疫记忆，迅速制造出更多份保护物质来阻断病原菌的入侵，从而使机体获得针对病原体特异性的免疫力，使其免受侵害而得到是保护。纯化是生物工程的下游技术，也是疫苗生产的下游工序，生产中所得病毒收获液经超滤器浓缩成为超滤液，经灭活水解、离心后的超滤液通过自吸泵进入层析柱，用洗脱液将目的蛋白洗脱下来，通过紫外蛋白检测仪检测，在280nm时记录仪中形成抗原峰，在抗原峰起峰时对纯化液进行收集至抗原峰结束，纯化液各检测指标合格后，方可转为半成品合并液，继而可分装成成品。纯化工序主要是由上述的层析系统完成的，即包括自吸泵、压力表、层析柱、紫外蛋白检测仪、电脑记录仪。纯化工序前要将填料（胶粒）进行充分浸泡（无气泡），注射用水将柱体清洗干净，柱体平衡后，柱体底层留2cm左右高的水面，参照层析柱使用说明书，安装预装柱，先将填料和注射用水混匀完全倒入柱体内，盖上预装柱盖子（盖子与液面完全贴合无气泡），连接自吸泵，高流速启动自吸泵，向下的流速可以提高胶体颗粒的重力和摩擦力，推动填料颗粒更快向柱底流动；当填料界面低于预装柱时，拆卸预装柱，安装柱头适配器1 （适配器底部与液面完全切合且无气泡），连接压力表，用水压法装柱如图1.1，打开水压入、出口阀，连接泵管和水压入口阀，高流速将0.2mol/LNaOH溶液泵入液压腔中，排出液压腔中空气，关闭水压出口阀，打开柱出口阀，继续向液压腔中泵入0.2mol/LNaOH溶液，当填料的弹性和柱头适配器的压力达到平衡时关闭自吸泵，关闭水压入阀，柱出口阀，柱体填装完毕。图1.1水压装柱法连接泵管与柱头适配器进液口，确认自吸泵转动方向与系统流路方向一致，排出泵管内气泡，用0.2mol/LNaOH溶液对层析柱进行在线清洗，用PBS缓冲液（pH7.2-7.8）平衡层析柱，连接紫外蛋白检测仪和电脑记录仪，确认层析系统能正常工作，层析柱工作压力小于1.5bar。层析柱是否能达到纯化分离效果可通过对层析柱的柱效进行评价。将2 1%丙酮溶液按柱胶体积的10%上样，用注射用水洗脱流速60ml/min，待峰落下后结束操作。根据色谱系统记录峰图如图1.2，计算HETP、柱效与对称因子。图1.2丙酮检测色谱图根据峰谱进行计算公式VeL2N=5.54（———）HETP=———WhN100bon=———Af=———HETPaN：理论塔板数Ve：洗脱体积Wh：半峰高处峰宽L：柱床高度oHETP：理论塔板高度n：每米理论塔板数Af：对称因子b：10%峰高处峰宽的后半部分oa：10%峰高处峰宽的前半部分要求：n≥3000，0.8≤Af≤1.23 理论塔板高度小于0.03µm（仅适用于本企业）。纯化工序在整个生产过程中占据较重要的位置，承担着较大的经济效益和风险，在规模生产的同时，有效地使用层析柱以保证疫苗高质量一直是一个被探讨的课题。而2010版《中国药典》（以下简称药典）的提出，使疫苗产业面临更多挑战，提高生产效率的同时要降低成本，规模化生产同时控制潜在的污染因素，宿主细胞蛋白残留量标准提高，要求我们着重对层析柱纯化工艺的深入研究，找到可行、可用的组合方式。本次实验使用的设备有凝胶层析柱，离子交换层析柱，两种层析柱因含有的介质结构不同对疫苗纯化的效果有所不同。凝胶过滤层析（Speharose4FastFlow，4FF，实验组合中简写为F）的基本原理是分子在多孔介质颗粒空隙中的液相与介质颗粒外部的液相之间按分子大小不同得到分配。混合组分通过凝胶层析柱时，大分子无法进入凝胶颗粒孔径，直接从颗粒外部的液相中最早被洗脱下来，而小分子通过凝胶颗粒孔径最后被洗脱下来，因此达到纯化分离的效果。凝胶过滤有很多优点，介质不带电荷，与被分离组分无吸附作用，操作简单，可连续使用，因而在生产中得到广泛应用。离子交换层析（Core700，实验组合中简写为C）的基本原理是带电电荷物质因电荷力作用而在固定相与流动相之间分配得以相互分离。Core700由激活的配基核心和惰性壳层组成，惰性壳层可以排阻大分子，阻止其经壳层上的孔进入核心，这些大分子在柱穿流中倍收集起来的同时，较小的杂质会与微球内在配基结合。其分辨率高，工作量大，操作简便，工作流速快，分离时间短。4 Core700上样量可达凝胶层析柱上样量的100倍，对较小的蛋白及污染物分离比较好，工作流速高，大大节省了工作时间，但不能完全替代凝胶层析柱，具体因素我们会在论文后部分进行讨论。本次实验分为两部分，第1个实验将两种层析柱设计了三种的组合方式即CFF、CFC、CCF，选取3个批次的超滤液，每一个批次都按照上述3种组合方式进行纯化分离，收集抗原峰，对比每一批次3个最终纯化液的分离效果，选取最优的组合方式，即为实验2的实验组合方式。第2个实验是根据实验1确定的结果进行进一步的验证性实验，验证其组合方式实施的重复性和可行性。5 第2章实验2.1实验试剂和仪器（一）试剂注射用水、0.1%苯扎溴铵溶液、0.5%胰蛋白酶溶液、水解乳蛋白、汉氏液、新生灭能小牛血清、NaHCO3、葡萄糖、199、Hank’s平衡盐、小牛血清、人血白蛋白、Na2HPO4、NaH2PO4、NaCl、NaOH。（二）仪器大容量沉淀离心机（转速为2890r/h）、琼脂糖凝胶层析柱（Speharose4FastFlow，4FF，胶体28L）、高度交联结合琼脂糖离子交换层析柱(Core700，胶体5L)、压力表、Uvi-920紫外蛋白检测仪、自吸泵、电脑记录仪。（三）主要试剂配制细胞生长培养液：注射用水、水解乳蛋白、新生小牛血清、NaHCO3，pH在7.2-7.4。细胞维持培养液：注射用水、葡萄糖、199、Hank’s平衡盐、小牛血清，人血白蛋白、NaHCO3，pH在7.5左右。0.9%NaCl溶液：配制质量分数为0.9%的NaCl溶液。PBS缓冲液：注射用水、NaCl、Na2HPO4、NaH2PO4,pH在7.2-7.8。0.5mol/LNaOH溶液：配制浓度为0.5mol/L的NaOH溶液。6%NaCl溶液：配制质量分数为6%的NaCl溶液。2.2样品制备见图2.1工艺流程。6 1、选取12-14日龄地鼠，无菌取肾细胞，剪碎，用胰蛋白酶溶液消化，2-8℃冷库16-20h。2、分散细胞，制备细胞生长培养液，进行3L瓶贴壁细胞培养，37℃恒温培养72h。3、加毒种（4aG2），34℃恒温培养24h。4、更换细胞维持培养液，34℃恒温培养96h。5、收获一次病毒液，更换细胞维持培养液，继续34℃恒温培养72h。6、收获二次病毒液，更换细胞维持培养液，继续34℃恒温培养72h。7、收获三次病毒液。8、检定单批病毒液无菌、抗原、毒力、内毒素、支原体、外源因子，检项结果应符合药典要求。9、将同批次的病毒液合并，并经30万分子量膜包超滤，按原液80倍浓缩，并按1:4000的比例加人β-丙内酯灭活、水解病毒[1]，检定超滤液无菌、灭活验证、蛋白含量，检项结果应符合药典要求[2]。7 生长液0.9%生理盐水冲更换更换更换地鼠筛选pH7.2-7.5洗、更换维持液维持液维持液维持液液浸泡消毒pH7.5pH7.5pH7.5pH7.501.12-%1苯扎溴铵溶4日龄16-20h培养72h培养24h培养96h培养72h培养72h解剖接种加毒洗换收一收二收三2-8℃消化pP8HB0S倍浓缩7缓冲液.2-PBS缓冲液检测无菌、抗原、毒力、内毒素、支原7.8pH7.2-7.8体、外源因子半成品纯化高速离心灭活、水解按1:4000的比例超滤加人β-丙内酯检测灭活、无菌、内毒素、蛋白、检测无菌、灭活验证、牛血清蛋白、宿主蛋白、抗原内毒素、蛋白含量图2.1工艺流程8 2.3疫苗样品纯化及检定共分为实验1和实验2。实验1中3批实验样品，每批都按3种不同组合方式过层析柱，根据最终纯化液的分离效果，确定实验2种层析柱组合方式。本种疫苗每剂装量为1ml。凯氏定氮法检定总蛋白含量，其含量≤80µg/ml。酶联免疫试剂盒检定牛血清残留蛋白含量，其含量≤50ng/ml。酶联免疫法(双抗体夹心法)检定宿主蛋白含量，其含量≤24µg/ml。双抗体夹心ELISA法检定抗原含量，其含量≥12IU/ml。（一）实验11、用PBS缓冲液（pH在7.2-7.8）平衡Core700，Core700特有上样量大性质，将样品2013L-S1以200±5ml/min速度全部泵入Core700，用PBS缓冲液洗脱，洗脱速度是200±5ml/min，电脑记录仪上出现的第一个峰即为抗原峰，其他为杂质峰，收集的抗原峰即为一次纯化液S1-C。2、将样品S1-C按照图2.2分3次上样，2次过4FF，1次过Core700，每次上样前需将样品S1-C摇匀，尽可能保证样品初始浓度一样，同时4FF[3]上样量制在柱床体积的1%～10%分离效果最佳。3、用PBS缓冲液（pH在7.2-7.8）平衡4FF，将样品S1-C的1/3量以160±5ml/min速度泵入4FF，洗脱速度120±5ml/min，电脑记录仪上出现的第一个峰即为抗原峰，其他为杂质峰，收集的抗原峰即为二次纯化液S1-CF1，同种方法收集二次纯化液S1-CF2。4、纯化液S1-C过Core700，收集二次纯化液S1-CC。9 5、纯化液S1-CC过4FF，收集三次纯化液S1-CCF。6、纯化液S1-CF1过4FF，收集三次纯化液S1-CF1F。7、纯化液S1-CF2过Core700，收集三次纯化液S1-CF2C。按上述方法纯化疫苗样品2013L-S2、2013L-S3。core700（C）core700-core700core700-4FFcore700-4FF(CC)(CF)(CF)core700-core700-4FFcore700-4FF-4FFcore700-4FF-core700(CCF)(CFF)(CFC)图2.2层析柱组合方式对三个批次的疫苗样品纯化前后的检定结果，见表2.1和表2.2。表2.1纯化前疫苗样品含量检测结果实验体积蛋白宿主蛋白牛血清蛋白抗原批号（L）（µg/ml）（µg/ml）（ng/ml）（IU/ml）2013L-S14.22216＞280232433.62013L-S24.22401＞280219033.72013L-S34.22817＞280231722.410 表2.2纯化后疫苗样品含量检测结果实验纯化前纯化后蛋白宿主蛋白牛血清蛋白抗原批号体积（L）体积（L）（µg/ml）（µg/ml）（ng/ml）(IU/ml)S1-C4.24.5223.5＞129＞21028.9S1-CC1.51.7101.268＞11224.6S1-CCF1.72.249.3195114.6S1-CF11.52.763.934＞6715.1S1-CF1F2.72.440.4174812.6S1-CF21.52.265.232＞7115.2S1-CF2C2.62.557.227＞5315.3S2-C4.24.521969＞17928.4S2-CC1.52.2118.245＞8318.6S2-CCF2.03.048.2215512.1S2-CF11.52.075.321＞5218.9S2-CF1F2.02.941.1124113.0S2-CF21.52.697.136＞6016.1S2-CF2C2.02.259.2215114.0S3-C4.24.8189.9＞108＞18725.8S3-CC1.61.9113.364＞11818.9S3-CCF1.92.752215312.9S3-CF11.62.585.628＞6715.6S3-CF1F2.52.941.4184213.1S3-CF21.62.378.622＞6715.2S3-CF2C2.12.551.9185213.611 100.000280nm[mv]79.600A59.20038.80018.400-2.0000.008.0016.0024.0032.0040.0048.0056.0064.0072.0080.00[min]S1-CF1F100.000280nm[mv]B79.60059.20038.80018.400-2.0000.008.0016.0024.0032.0040.0048.0056.0064.0072.0080.00[min]S2-CF1F100.000280nm[mv]C79.60059.20038.80018.400-2.0000.008.0016.0024.0032.0040.0048.0056.0064.0072.0080.00[min]S3-CF1F图2.3疫苗样品纯化液S-CFF紫外吸收图谱12 表2.3疫苗样品最终纯化液的纯化效率纯化液批号蛋白去除率抗原回收率抗原纯度（归一法）S1-CF1F95.96%83.04%68.99%S2-CF1F96.45%79.91%85.10%S3-CF1F96.96%83.75%75.51%由表2.1和表2.2可知：1、二次纯化液S1-CF1总蛋白含量为63.9µg/ml，宿主蛋白含量为34µg/ml，牛血清蛋白含量大于67ng/ml；S1-CF2总蛋白含量为65.2µg/ml，宿主蛋白含量为32µg/ml，牛血清蛋白含量大于71ng/ml；均低于S1-CC总蛋白含量为101.2µg/ml，宿主蛋白含量为68µg/ml，牛血清蛋白含量大于112ng/ml。2、二次纯化液S2-CF1总蛋白含量为75.3µg/ml，宿主蛋白含量为21µg/ml，牛血清蛋白含量大于52ng/ml；S2-CF2总蛋白含量为97.1µg/ml，宿主蛋白含量为36µg/ml，牛血清蛋白含量大于60ng/ml；均低于S2-CC总蛋白含量为118.2µg/ml，宿主蛋白含量为45µg/ml，牛血清蛋白含量大于83ng/ml。3、二次纯化液S3-CF1总蛋白含量为85.6µg/ml，宿主蛋白含量为28µg/ml，牛血清蛋白含量大于67ng/ml；S3-CF2总蛋白含量为78.6µg/ml，宿主蛋白含量为22µg/ml，牛血清蛋白含量大于67ng/ml；均低于S3-CC总蛋白含量为113.3µg/ml，宿主蛋白含量为64µg/ml，牛血清蛋白含量大于118ng/ml。13 4、二次纯化液S-CF的总蛋白含量、牛血清蛋白含量、宿主蛋白含量均低于二次纯化液S-CC中相应成分的含量；4FF对蛋白去除效果优于Core700，CF组合优于CC组合，所以在第二步纯化时应选CF组合。5、最终纯化液中，S1-CF1F总蛋白含量为40.4µg/ml，宿主蛋白含量为17µg/ml，牛血清蛋白含量为48ng/ml；低于S1-CF2C总蛋白含量为57.2µg/ml，宿主蛋白含量为27µg/ml，牛血清蛋白含量大于53ng/ml；2013L-S2、2013L-S3最终纯化液CFF的总蛋白含量、牛血清蛋白含量、宿主蛋白含量也均低于最终纯化液CFC中相应成分的含量；组合CFF的纯化效果优于CFC，应选择CFF的组合方式。6、同时最终纯化液S1-CF1F、S2-CF1F、S3-CF1F中总蛋白含量、宿主蛋白含量、牛血清蛋白含量均低于药典规定的总蛋白含量为80µg/ml，宿主蛋白含量为24µg/ml，牛血清蛋白含量为50ng/ml，符合药典规定。由图2.3和表2.3可得，CFF纯化分离后蛋白去除率可达95%以上，抗原回收率在79%以上，抗原纯度（归一法）高于68%，比较符合生产需要。由以上结论确定CFF为实验2中两种层析柱组合方式。14 （二）实验2根据实验1的结论，我们另选取3组浓缩原液样品2014L-S4、2014L-S5、2014L-S6均以CFF方式上样进行验证实验，方法如图2.4。2014L-S4Core700-4FF-4FF2014L-S5(CFF)2014L-S6图2.4层析柱组合方式1、用PBS缓冲液（pH在7.2-7.8）平衡Core700，将样品2014L-S4以200±5ml/min速度泵入Core700，洗脱速度200±5ml/min，电脑记录仪上出现的第一个峰即为抗原峰，其他为杂质峰，收集的抗原峰即为一次纯化液S4-C。2、用PBS缓冲液平衡4FF，将样品S4-C过4FF，上样速度160±5ml/min，洗脱速度120±5ml/min，同时4FF上样量在控制在柱床体积的1%～10%分离效果最佳，电脑记录仪上出现的第一个峰即为抗原峰，其他为杂质峰，收集的抗原峰即为二次纯化液S4-CF，同种方法收集三次纯化液S4-CFF。按上述方法纯化样品2014L-S5、2014L-S6。15 三个实验组纯化后的检定结果见表2.4、表2.5。表2.4纯化前疫苗样品含量检测结果实验体积蛋白宿主蛋白牛血清蛋白抗原批号（L）（µg/ml）（µg/ml）（ng/ml）（IU/ml）2014L-S43.22335.5＞290＞235234.82014L-S53.52421.4＞366＞235133.82014L-S63.52601.2＞628＞241333.5表2.5纯化后疫苗样品检测结果实验纯化前纯化后蛋白宿主蛋白牛血清蛋白抗原批号体积（L）体积（L）（µg/ml）（µg/ml）（ng/ml）(IU/ml)S4-C1.61.7＞112117S4-CF1.72.54746S4-CFF1.21.842.4142813.2S5-C1.71.9＞133＞162S5-CF1.92.63342S5-CFF1.31.745.692713.5S6-C1.51.8＞17532S6-CF1.82.44815S6-CFF1.21.839.413﹤2.512.516 100.000280nm[mv]79.60059.200D38.80018.400-2.0000.008.0016.0024.0032.0040.0048.0056.0064.0072.0080.00[min]S4-CFF100.000280nm[mv]79.60059.200E38.80018.400-2.0000.008.0016.0024.0032.0040.0048.0056.0064.0072.0080.00[min]S5-CFF100.000280nm[mv]79.60059.200F38.80018.400-2.0000.008.0016.0024.0032.0040.0048.0056.0064.0072.0080.00[min]S6-CFF图2.5疫苗样品纯化液S-CFF紫外吸收图谱17 表2.6疫苗样品最终纯化液的纯化效率纯化液批号蛋白去除率抗原回收率抗原纯度（归一法）S4-CFF95.75%88.90%76.09%S5-CFF96.23%79.88%78.81%S6-CFF96.36%89.55%82.61%由上述表2.4和表2.5可看出，离子交换层析与凝胶层析以Core700-4FF-4FF的顺序组合方式纯化地鼠肾细胞狂犬病疫苗后，S4-CFF总蛋白含量为42.4µg/ml，宿主蛋白含量为14µg/ml，牛血清蛋白含量为28ng/ml；S5-CFF总蛋白含量为45.6µg/ml，宿主蛋白含量为9µg/ml，牛血清蛋白含量为27ng/ml；S6-CFF总蛋白含量为39.4µg/ml，宿主蛋白含量为13µg/ml，牛血清蛋白含量为﹤2.5ng/ml。均低于药典规定的总蛋白含量为80µg/ml，宿主蛋白含量为24µg/ml，牛血清蛋白含量为50ng/ml，符合药典规定。由图2.5和表2.6可得，经CFF纯化后的3批纯化液蛋白去除率达95%以上，抗原回收79%以上，抗原纯度（归一法）高于76%，均达到生产需要。通过实验1和实验2可以确定层析柱以CFF组合方法得到的纯化液各蛋白含量均符合药典规定，符合生产需要，而且实验有重复性，也具有可操作性。18 第3章结论与讨论3.1结论由实验1、实验2结果可以得出，凝胶层析与离子交换层析以Core700-4FF-4FF的组合方式对实验样品纯化分离的效果优于Core700-Core700-4FF和Core700-4FF-Core700。最终纯化液CFF中总蛋白含量、牛血清残留蛋白含量、宿主蛋白残留含量均符合药典要求，蛋白去除率达95%以上，抗原回收率在79%以上，抗原纯度68%以上。两种层析柱的组合能有效地降低蛋白含量，实验重复性好，可以在实际生产中进行中试实验，对分离效果进行追踪分析，分离效果长期稳定则可以考虑作为优化纯化工艺的一个方法。提高纯化效率的方法有很多，可以从样品上样量[3]，上样的速度，上样浓度[4]等方面进行优化，也可以通过将不同层析柱组合在一起使用[5]，结合各层析柱的优势，确定一种既符合药典要求又适用于药企生产需要的纯化工艺。3.2讨论1、现代人用狂犬病疫苗主要有：纯化地鼠肾细胞狂犬病疫苗（PHKCV），纯化鸡胚细胞狂犬病疫苗（PCECV），人二倍体细胞狂犬病疫苗（HDCV），纯化Vero细胞狂犬病疫苗（PVEV）。人用二倍体细胞疫苗优于其他疫苗，但对工艺要求较高，难以大规模生产，Vero细胞疫苗存在异源蛋白引起的机体过敏反应。原代细胞疫苗最大优势就是安全性高[6]，但工艺步骤多，效价低，提高疫苗效价要求我们制备的细胞密度大，繁殖力强[7]，细胞的毒力含量高，保证纯化前病毒液有较高的效价，同时要提高纯化分离效果，19 减少抗原、效价的损失，提高回收率。2、在细胞培养过程中由于加入了无机盐、有机物等营养物质，在纯化分离过程中尤其牛血清蛋白比较难除，有文章提出在生产中用人血白蛋白代替维持液中的小牛血清，减少后期牛血清蛋白含量[7]，但人血白蛋白成本较高，可以进一步优化去除牛血清的方法或是找到小牛血清的替代品。3、凝胶层析（4FF），其原理可以理解成是一个分子筛，大分子的组分从孔隙中分离出去，很多小分子经过凝胶孔径中最后被洗脱出去，超滤液虽然是经过粗滤处理，但仍有一些杂质，纯化过程中可以看到有一些细屑状杂质附着在层析柱进液口表面，而凝胶柱的柱床较高，长期使用后有很多小分子会滞留在凝胶孔径中，因此有些凝胶柱长时间使用后颜色会偏灰黑，进液口压力表明显压力变大，但实际流速会减慢，扩散速度降低，分离时间较长，抗原未完全流出时，后面的杂质蛋白就有可能追上来，可能与抗原一同被收集，此时图谱中抗原峰出现拖尾，并与杂质峰连线较高，分离效果受影响。收集抗原后需将4FF内杂质充分洗脱，至无杂质峰，但胶体多在线清洗时间较长，可达200分钟左右。4、离子交换层析（Core700），新型的核心微球技术及复合模式，吸附性较强，在分离杂质时有明显的优势，小分子蛋白及一些污染物结合在核心微球的配基上，大分子蛋白会被排阻在微球外，在穿流过程中通过层析柱，PBS缓冲液洗脱收集大分子蛋白时，损失相对较少。用6%NaCl溶液对杂蛋白及污染物PH进行调节，配制0.5mol/LNaOH溶液洗脱杂蛋白，由于Core700胶体比4FF少，虽然CIP步骤较多但操作时间短，合理安排20 使用、清洗时间，在实际生产中重复使用率较高。5、疫苗浓缩后抗原含量增加，但一些引起毒副反应的物质同样地也被浓缩[8]，而Core700具有激活的配基核心以及未激活的壳层的核心微球技术可有效的捕获污染物，同时使目标分子流穿。对小分子蛋白及污染物去除较好，保证了最后过4FF的样品的安全性。因此根据长期经验，我们将凝胶层析柱与离子交换层析柱组合使用时，考虑到Core700特有的上样量大，工作时间短，分离杂质效果好，可先除去小分子蛋白和一些污染物，减少后期可能出现的杂质对4FF的堵塞及污染；Core700收集的一次纯化液体积较多，可以分多次上4FF，由操作引起的样品污染比例小，而如果将4FF作为第一步骤，将4FF收集的一次纯化液合并一起再过Core700，4FF中单次污染的纯化液便将其他纯化液连同Core700层析柱一起污染；所以我们将Core700作为第一步骤，以短时间收集大量一次纯化液，再进行4FF的纯化分离。6、提高蛋白去除率、抗原回收率和纯度，除了从制备细胞方面考虑，还可以从层析柱本身入手，定期用0.2～0.5mol/LNaOH溶液在线清洗层析柱，将柱体内的滞留的杂质及污染物洗出；长时间使用层析柱，层析柱分离效果会减弱，可采用室温溶胀或沸水浴溶胀再生胶体，胶体溶胀充分，安装时，使胶体均匀分布在柱内，避免产生气泡和分层断层现象[9]，合理柱高，提高柱效。在实验1最终纯化液紫外检测图谱中有前沿峰出现，原因是上样量过多、样品浓度大影响了分离效果（已排除填料过紧因素），我们在实验2中相应减小了上样量，最终纯化液上样量控制在胶体积的5%左右，实验2中紫外图谱峰形对称，分离效果较好，抗原回收率、纯度21 有所提高，可再进一步精确合适上样量以提高抗原回收率和纯度。7、不同层析柱组合使用不完全是唯一的方式，凝胶层析柱分离蛋白效果较好，可以考虑将几根同种凝胶层析柱串联连接使用，从第一根层析柱纯化出来的不同组分，按被分离顺序依次进入第二根层析柱，连续分离，理论上效果会更好，但仍需确认上样量、上样速度、洗脱速度、工作压力，同样其分离效果也是需要我们去验证。8、在使用层析系统纯化分离的同时，要注意对层析系统定期进行清洁、维护及保养：（1）对自吸泵进行维护、保养，定期对自吸泵线路、开关检查，测试自吸泵屏幕显示的数值与实际流速是否一致，不一致时要对自吸泵的流速进行调节校准。（2）对压力表进行校准，层析系统工作压力在1.5bar以内，层析柱最大安全压力为3bar，压力表灵敏度不正常，不能正确反映层析柱内的压力状态，影响层析系统正常工作及生产安全。（3）对层析柱进行清洁、维护及保养，层析系统正常工作时对层析柱进行在线清洗，不使用时用0.2～0.5mol/LNaOH溶液清洗后封柱；定期对柱胶通透性检测，蠕动泵流速在200ml/min时，层析柱压力在0.5bar以内，通透性不良时要对胶体溶胀清洁，对层析柱重新填料；对层析柱各个配件及旋钮进行检查，避免有泄漏情况。（4）对层析系统所有连接管道进行检查，更换有老化或有裂缝管道，避免有泄漏情况发生。（5）对紫外蛋白检测仪进行维护、保养，检测仪和滤光片对环境湿22 度敏感，为保证寿命，对使用环境的湿度要求较高，使用后要及时移至干燥处保存，另外尤其是在生产车间会经常对操作室进行熏蒸消毒，此时也应将检测仪移至适合地点，不在不使用时开机，合理使用滤光片可以延长其使用寿命，减少成本损失；及时更换超出寿命的滤光片，避免影响图谱效果。（6）对电脑记录仪进行维护、保养，定期检查电脑配件，查看内存大小，保证紫外图谱有存储空间，减少不必要的损失。纯化是操作简单却对细节要求较高的一个工艺环节，要熟悉纯化工序的各个参数，了解可能发生的各种操作风险，针对异常状况采取特定的解决方法，保证纯化工序稳步进行，生产出高质量的疫苗。23 参考文献[1]李福安,等.β-丙内酯在人用狂犬病疫苗制备中的应用[J]中国生物制品学杂志,1999:12(1),7.[2]国家药典委员会编.《中华人民共和国药典》（三部）.2010.[3]李福安,杨学平,窦志勇.人用地鼠肾细胞狂犬病疫苗纯化工艺中上样量的选择[J].中国人兽共患病杂志，2001,17(5):115-116.[4]李福安,秦怡,谢强.人用地鼠肾细胞狂犬病疫苗纯化工艺中样品浓度对纯化效果的影响[J].中国媒介生物学及控制杂志，2001,12(6):471.[5]蒋国润,周东霞,孙明，等.层析技术纯化核酸疫苗[J].中国生物制品学杂志,2007,20(2):129-132.[6]李冲之.2010年版中国药典的实施对人用狂犬病疫苗产业化的影响[R].2011新型疫苗与抗体创制关键技术及质量控制研讨会,2011.[7]张玉慧,高春润,孙秀华,等.狂犬病疫苗纯化工艺的建立[J].中国生物制品学杂志,1999,4(12):231-232.[8]王玉琳.纯化狂犬疫苗及其方法的研究进展[J].微生物学免疫学进展,1999,4(27):87-89.[9]杨洪涛,等.生物化学教学实验图聚糖凝胶层析的改进和完善.[J].实验室科学,2013,2(16):10-12.[10]李艳.凝胶层析和离子交换层析结合法纯化重组降血压肽[J].食品工业科技,2014,35(17):111-114.[11]鲁宏,窦志勇,钱浩,等.地鼠肾细胞狂犬病毒疫苗的纯化研究[J].24 中国人兽共患病杂志,1999:15(2)42.[12]吕宏亮.精制地鼠肾细胞狂犬病疫苗纯化工艺的建立[J].生物技术讯,2001,8(3):205-207.[13]王凤山,主编.生物技术制药[M].北京：人民卫生出版,2011.[14]吴梧桐,主编.使用生物制药学[M].北京：人民卫生出版,2007.[15]俞永新,主编.狂犬病和狂犬病疫苗[M].北京:中国医药科技出版社,2009.25 作者简介及在学期间所取得的科研成果作者姓名杨莲花，女，1985年12月30日生于吉林省吉林市，汉族，2009年毕业于吉林工程技术师范学院，生物工程本科专业，工学学士，现就职于吉林亚泰生物药业，目前是初级助理工程师。2010年进入生物药企行业，从事人用地鼠肾细胞狂犬病疫苗生产解剖岗位工作，主要工作是细胞培养：地鼠的解剖、细胞消化—细胞接种培养—毒种加毒—洗换—收获；2012年企业新上了罐培养系统，采用自动化配液供液，我主动要求调入配液部门，学习新技术，辅助部门领导修改、建立相关操作SOP及配套辅助记录，参与新工艺认证工作；2014年进入纯化组，参与一系列层析柱应用实验及纯化再验证工作。多年来积累了生产准备、配液、纯化等方面的工作经验，也对生物制药行业有着深刻的了解，生物制药是一个复杂的过程，其中的影响因素有很多，也有很多微小的因素是我们注意不到，但又确实能影响最后的结果，这就要要求我们生物制药人对工作投入的细心和关注。对于目前生产中比重较大的纯化工序，纯化工艺优化的研究一直是我们不断研究的课题，相信在我们不断的努力下，也在全生物制药人对工艺不断的研究下，我们的生物制药行业会有更大的提升和进步。26 致谢本篇论文在吉林大学王毅教授的指导下完成，在此对王毅老师表示感谢！在吉林大学学习期间，得到了张锡平老师的帮助，在此对张锡平老师表示感谢！本次实验是实际生产中进行，感谢车间各岗位的同事的积极配合，感谢纯化小组全体成员对实验做出的努力，感谢车间领导及技术员对工艺技术指导，感谢质量部对样品的及时检测和结果反馈！27