异丙酚对子宫内膜癌细胞的影响及其作用机制研究

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1、分类号：164.1密级：公开学校代码：11065学号：y0115130149专业博士学位论文异丙酚对子宫内膜癌细胞的影响及其作用机制研究作者姓名杜青指导教师王士雷教授专业领域麻醉学培养单位临床医学院答辩日期2018年5月12日异丙酚对子宫内膜癌细胞的影响及其作用机制研究摘要目的：异丙酚（2,6-diisopropylphenol,propofol）是一种常见的静脉注射麻醉剂，而且异丙酚在各种癌症中也具有明显的抗肿瘤功能。性别决定区相关高迁移率族盒（Sex-determiningregionY-box,Sox）4不仅可以参与胰腺的发育、胚胎心脏、中枢神经系统及

2、淋巴细胞发展和分化等生理生化反应，而且在肿瘤的形成、发育和增殖过程中也具有重要的作用。但是，异丙酚对于子宫内膜癌（Endometrialcancer）和对Sox4的研究较少，因此本文通过研究异丙酚对子宫内膜癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响，意在揭示异丙酚在子宫内膜癌细胞中的作用及其潜在的分子机制。方法：1为了研究异丙酚对子宫内膜癌的影响，我们取对数生长期的Ishikawa细胞和HEC-50细胞，以500个/孔的密度接种到6孔板中，采用2μg/ml、4μg/ml和6μg/ml等不同浓度的异丙酚处理人子宫内膜癌细胞株，培养14天后，然后采用集落形成试验检测异丙

3、酚对人子宫内膜癌细胞株克隆能力的影响。将细胞接种到6孔板（1×105个/孔的密度）上培养48小时，采用AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测Ishikawa细胞的凋亡率。用无血清的DMEM/F12培养液洗涤细胞，采用8-µm孔隙聚碳酸酯过滤器的24孔侵袭小室检测孵育12小时后细胞的迁移能力、将基质胶用无血清DMEM/F12培养基稀释，然后采用8-µm孔隙聚碳酸酯过滤器的24孔侵袭小室检测孵育12小时后细胞的侵袭能力。同时采用蛋白免疫印迹法检测细胞周期蛋白依靠性激酶抑制剂p21、细胞周期素E1（CyclinE1）和CyclinD1等细胞周期相关

4、因子，Bid、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2associatedX,Bax）和活化半胱天冬酶3（activecaspase3）等细胞凋亡相关蛋白以及基质金属蛋白酶9（Matrixmetallopeptidase9,MMP9）和MMP2等细胞迁移相关蛋白表达水平。并且为了进一步检测异丙酚对Ishikawa细胞增殖的影响，我们采用4μg/ml的异丙酚连续处理Ishikawa细胞4天，并通过采用3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumBrom

5、ide,MTT）比色法检测Ishikawa细胞的活性和流式细胞仪检测Ishikawa细胞周期变化情况。2为了研究Sox4对子宫内膜癌细胞的作用，我们采用实时荧光定量PCR（Quantitativereal-timePCR,qRT-PCR）检测了不同浓度的异丙酚（2μg/ml、4μg/ml和6μg/ml）处理下Ishikawa细胞中Sox4的mRNA表达水平。然后按照制造商说明书采用脂质体2000试剂，将pcDNA3.1-Sox4（Sox4过表达载体）、si-Sox4（特异性抑制ISox4的短发夹RNA）以及si-NC（si-Sox4的阴性对照）转染到生长良好

6、的Ishikawa细胞。共分为3组:异丙酚组（4μg/ml），Ishikawa细胞用4μg/ml的异丙酚处理24小时；异丙酚+pcDNA3.1-Sox4组，Ishikawa细胞转染pcDNA3.1-Sox4然后用4μg/ml的异丙酚处理24小时；异丙酚+si-Sox4组：Ishikawa细胞转染si-Sox4然后用4μg/ml的异丙酚处理24小时。采用蛋白免疫印迹法检测Sox4过表达或Sox4沉默表达的细胞中的Sox4蛋白表达水平。同时通过免疫组织化学检测4μg/ml的异丙酚处理下pcDNA3.1-Sox4组、si-NC组及其相应对照组细胞中Ki67+细胞的

7、数目。采用4μg/ml的异丙酚处理pcDNA3.1-Sox4转染细胞，然后通过BALB/c-nu裸鼠（6周龄）成瘤实验检测异丙酚和Sox4对Ishikawa细胞的影响。采用注射器将0.2ml细胞悬浮液注射到小鼠两侧的腹部，使接种细胞总数为1×109个/只。正常饲养4周后，解剖并获得肿瘤。观察称量肿瘤的大小和重量，并拍照对比。3为了研究异丙酚在子宫内膜癌的可能的信号通路，我们首先采用蛋白免疫印迹法分别检测不同浓度的异丙酚（2μg/ml、4μg/ml和6μg/ml）条件下Ishikawa细胞的核β-catenin和总β-catenin的表达水平。进而，我们采用蛋

8、白免疫印迹法分别检测异丙酚在不同处理时间（0、2、4