大菱鲆免疫球蛋白d重链基因的克隆与表达研究

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1、分类号密级UDC研究生学位论文大菱鲆免疫球蛋白D重链基因的克隆与表达研究研究生姓名陈孔茂指导教师姓名战文斌教授申请学位级别硕士专业名称水产养殖论文答辩日期2013年5月学位授予日期2013年6月中国海洋大学谨以此论文献给所有关心、支持和帮助过我的亲人、师长和朋友！——陈孔茂大菱鲆免疫球蛋白D重链基因的克隆与表达研究学位论文答辩日期：2013年5月指导教师签字：答辩委员会成员签字：独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人

2、已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日---------------------------------------------------------------------学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编

3、入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导师签字：签字日期：年月日签字日期：年月日大菱鲆免疫球蛋白D重链基因的克隆与表达研究摘要本论文克隆了大菱鲆mIgD基因cDNA全序列，序列特性分析显示其含有免疫球蛋白家族所有的经典结构域。RT-PCR分析该基因在不同组织内的差异表达情况，实时荧光定量PCR检测鳗弧菌刺激后前肾中该基因的

4、时空差异表达情况，推测鱼类mIgD在免疫信号传导及体液免疫防御中均可能起着重要作用。在序列分析的基础上对其进行分段表达，构建mIgD的δ区重组表达载体，并制备了其多克隆抗体。利用其与大菱鲆外周血白细胞间接免疫荧光实验，结果显示两者发生了特异性结合，说明了外周血白细胞的细胞膜上存在膜结合型mIgD。本论文主要包括以下三部分：1大菱鲆免疫球蛋白D重链基因的克隆设计简并引物扩增大菱鲆免疫球蛋白D重链基因的中间保守序列，通过RACE技术获得mIgDcDNA序列，序列全长3357bp，含一个2997bp的开放阅读框，编码999个氨基

5、酸，基因结构为VDJ-μ1-δ1-δ2-δ3-δ4-δ5-δ6-δ7-TM。重链恒定区δ1~δ7氨基酸序列同源比对结果显示其与庸鲽（78%）、鳜鱼（71%）、牙鲆（68%）具有较高的同源性，多序列比对结果显示大菱鲆mIgD的每个δ恒定区内均存在色氨酸与半胱氨酸保守位点。利用邻位相连法构建硬骨鱼类免疫球蛋白系统发育树，结果显示不同鱼类IgD聚为一大支，大菱鲆mIgD与庸鲽及牙鲆聚为一支。2大菱鲆mIgD重链基因的表达分析利用RT-PCR分析了大菱鲆mIgD重链基因的组织差异表达，结果显示其在外周血白细胞、脾脏、前肾及中肾组织

6、中具有较高的表达。将大菱鲆腹腔注射福尔马林灭活鳗弧菌后，实时荧光定量PCR检测了其前肾组织中mIgD重链基因应答表达量，结果显示mIgD重链基因在注射鳗弧菌后呈现显著下调趋势，在注射后8h时降至最低值，其相对表达量约为对照组的1/28左右，然后呈逐渐回复上调趋势，在免疫后48h时免疫组mIgD相对表达量与对照组无显著差异水平。3大菱鲆mIgDδ恒定区基因的重组表达及其多抗的制备构建了mIgDδ恒定区融合表达载体pET32a-δ-mIgD，转入大肠杆菌后成功表达，获得分子量大小为99.5kDa的重组蛋白。另外制备了鼠抗大菱鲆

7、mIgD抗血清，ELISA实验结果显示，pET32a-IgDδ恒定区重组表达蛋白与鼠抗大菱鲆mIgD抗血清具有结合活性。利用该多抗通过间接免疫荧光发现该抗体能与大菱鲆外周血白细胞发生特异性结合，结果说明了外周血白细胞的细胞膜上存在膜结合型IgD。关键词：大菱鲆；免疫球蛋白D；基因克隆；荧光定量PCR；免疫荧光。MolecularcloningandexpressionanalysisofimmunoglobulinDheavychaininScophthalmusmaximusAbstractInthispaper,ful

8、llengthcDNAsequenceofmIgDwasclonedfromthespleenofScophthalmusmaximus,Sequenceanalysisshowedthatitcontainedtheclassicdomainoftheimmunoglobulinfamily.RT-P