小鼠眼部碱烧伤后骨髓间充质干细胞归巢到角膜组织的检测及影响因素分析

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1、摘要第一章小鼠碱烧伤完全性角膜缘干细胞功能失代偿模型的建立及评价目的建立模拟临床的小鼠碱烧伤完全性角膜缘干细胞功能失代偿模型，为研究碱烧伤引发的完全性角膜缘干细胞功能失代偿提供简单、稳定的动物模型。方法选取6—8周龄C57小鼠30只，全身麻醉后将浸有0．5mol／L氢氧化钠溶液的环形滤纸片(内径3mm，外径5ram)置于角膜缘30秒后取下，然后应用生理盐水冲洗结膜囊30秒；术后1天、3天、5天、7天、10天、14天、21天及30天，应用裂隙灯显微镜观察角膜上皮完整性、基质透明性及新生血管化情况；每个时间点随机抽取3

2、只小鼠取材，进行组织病理学检查；术后21天进行角膜免疫印迹细胞学检查。结果①裂隙灯检查：术后1天：角膜缘缺血，可见边界清楚的灰白色环状混浊区，大小与滤纸片直径一致，全角膜水肿、上皮缺损；术后3—5天：角膜灰白色混浊，水肿加重；术后7-10天：角膜水肿逐渐减轻，上皮恢复完整；术后14天：角膜缘可见毛刷状新生血管生长；术后21天：角膜缘较多新生血管长入角膜基质；术后30天：角膜混浊、新生血管化，部分模型发生睑球粘连；②HE染色：术后卜5天：角膜上皮层、基质层内可见大量炎症细胞浸润，角膜基质水肿、明显增厚、胶原纤维排列不

3、规则、较疏松；术后7-10天：角膜表面单层上皮覆盖，基质水肿逐渐减轻，炎症细胞浸润减少；术后14天：角膜表面覆盖2—3层上皮细胞，基质无明显水肿，胶原纤维排列相对整齐；术后21天：角膜基质内较多新生血管增生，管腔内有成熟红细胞；术后30天：角膜上皮层内可见较多杯状细胞；③免疫印迹细胞学检查：角膜表面可见较多核大、核质比例约1／2、嗜伊红染色的杯状细胞，PAS染色阳性，为结膜细胞表型。结论①应用环形滤纸片碱烧伤的方法制作小鼠完全性角膜缘干细胞功能失代偿模型，角膜表面可见较多杯状细胞，裂隙灯检查见小鼠角膜的体征符合临床

4、上“完全性角膜缘干细胞功能失代偿”的诊断标准。②此方法操作简单，易于重复，为下一步的在体研究提供了良好的动物模型。第二章小鼠眼部碱烧伤急性期骨髓间充质干细胞归巢到角膜组织的检测目的观察小鼠眼部碱烧伤急性期骨髓间充质干细胞归巢到角膜组织的时间窗、定植位置、以及影响因素。方法选取6—8周龄C57小鼠80只，随机分为骨髓功能正常组、骨髓功能动员组(皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子)及球结膜下注射组(球结膜下注射GFP转染的小鼠骨髓问充质干细胞)，建立完全性角膜缘干细胞功能失代偿模型，分别于碱烧伤后1天、3天、5天、7天、

5、10天、14d天、2l天及30天取材：①冰冻切片行CD29、CD44及CD45免疫荧光染色；球结膜下注射组应用荧光显微镜观察GFP阳性细胞在眼表的位置；②实时定量PCR检测CD29、CD44、CD45、CD90、CDl05及基质衍生因子1(SDF-1)的表达；③包埋切片行SDF一1免疫组织化学检测。结果①免疫荧光染色：两组呈现类似的表达规律：碱烧伤术后卜10天，角膜中央、周边及角膜缘均未见CD29、CD44及CD45表达；术后14d、21d、30d，角膜缘可见少量CD29、CD44阳性表达，阳性反应物主要位于胞膜，

6、但CD45均为阴性。②荧光显微镜：术后1天、3天、5天及7天，球结膜下、角膜缘及角膜中央均未见GFP阳性细胞：③实时定量PCR：两组呈现类似的表达规律：CD29、CD44、CD90及CDl05：碱烧伤术后1-7天均未见表达，术后10天、14天、21天、30天呈现低水平表达；CD45：各个时间点均为阴性。④免疫组织化学检测：两组呈现类似的表达规律：术后7天：SDF一1呈现强阳性表达，阳性反应物主要位于角膜上皮细胞胞浆内；术后10一14天：阳性反应物逐渐减少；术后21天：SDF一1表达呈现阴性。结论①小鼠眼部碱烧伤后1

7、4-30天，仅有少量骨髓间充质干细胞归巢到角膜组织并聚集在角膜缘部位。②小鼠眼部碱烧伤后SDF一1表达增加，时间一剂量关系与心肌等组织相似，不是抑制骨髓间充质干细胞归巢的关键因素。第三章眼表炎症因子及高渗透压环境对小鼠骨髓间充质干细胞生物学性状的影响目的检测眼表主要炎症因子(白介素一1B)及高渗透压环境(4060sm)对小鼠骨髓间充质干细胞形态、活细胞率、增殖及迁移能力等生物学性状的影响。方法体外分离小鼠骨髓间充质干细胞进行培养，设置正常对照组、5ng／ml工L一1B组、10ng／mlIL一1B组、20ng／mlI

8、L一1B组及高渗组，分别应用MTT法、细胞克隆形成试验、划痕法进行检测。结果①细胞形态：原代培养的细胞呈梭形，排列具有方向性，胞浆丰富，细胞核较大，呈圆形，位于细胞中央；5ng／mlIL一1B组细胞形态无明显差异；随着培养基中IL一10浓度升高，出现较多漂浮细胞，细胞变小，多呈圆形；高渗组培养基中出现大量漂浮细胞，贴壁细胞排列松散，形态不规则，失去梭形外观，