人羊膜间充质干细胞移植对兔角膜碱烧伤的疗效及磁标记示踪分析

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1、Athesis(dissertation)submittedtoZhengzhouUniversityForthedegreeofdoctorTheeffectsofSPIONs．1abeledamnioticmembrane．derivedmesenchymalstemcelltransplantation．1l1‘●1’●’’‘0nalRaliDUrnmonelinrabbitByLiYanweiSupervisor：Prof．Zhu跏YUDepartmentofOphthalmologyFirstHospit

2、alofZhengzhouUniversityMarch2013学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：考穆／中日期：矽／弓年y月弓JEl学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意

3、学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：艚午日期：3,o1弓年J月孑／日摘要人羊膜间充质干细胞移植对兔角膜碱烧伤的疗效及磁标记示踪分析背景和目的角膜碱烧伤后，碱性物质能够迅速渗透眼表面，通过细胞渗透、蛋白水解酶和

4、细胞因子的分泌导致严重的特征性的炎症反应。为保护角膜上皮的完整性，阻止基质层溃疡发生，国内外学者们已经应用了多种治疗方法，均取得了一定的疗效，但是何为最佳疗法，至今仍有争议，并未确定。本研究分别通过四个阶段探讨磁标记人羊膜间充质干细胞(humanamnioticmembrane．derivedmesenehymalstemcells，hAM—dMSCs)移植对兔角膜碱烧伤治疗的影响，以及碱烧伤后泪液乳铁蛋白(1actoferrin，LF)的表达，研究泪液LF与碱烧伤的关系及其意义，以期获得对于角膜急性碱烧伤较为简易

5、且适于临床使用的最佳治疗方法。1．通过观察人羊膜组织来源的细胞形态学、流式细胞仪检测和MTT法活性细胞检测等鉴定原代获取的问充质干细胞，为后续的实验提供干细胞。2．不同方法标记原代培养的羊膜问充质干细胞，探索最合适的细胞标记方法。3．超顺磁性氧化铁纳米颗粒(Superparamagneticironoxidenanoparticles，SPIONs)标记的hAM．dMSCs局部移植入角膜碱烧伤眼结膜下，观察细胞在宿主存活和迁徙情况；联合传统的羊膜移植，通过临床检查及检测IL．1p和TNF．0【评估治疗效果，探讨干细

6、胞在角膜碱烧伤后组织再生中扮演的角色。4．采集正常和碱烧伤治疗后的兔泪液，采用放射免疫分析方法，分别测定其中LF的含量，研究泪液LF与碱烧伤的关系及其对碱烧伤愈合的意义。材料和方法1羊膜间充质千细胞的原代培养和鉴定使用酶消化和贴壁筛选法获取人羊膜组织中的间充质干细胞，反复传代对其扩增和纯化细胞。通过观察细胞学形态、MTT法活性检测和流式细胞仪检测摘要等鉴定人羊膜来源的间充质干细胞。通过显微镜观察细胞的形态变化；采用流式细胞术检测人羊膜来源的细胞膜表面特异性蛋白分子CD31、CD44、CD45、CD90、CD29、C

7、D34的表达。2．SPIONs标记的羊膜间充质干细胞在体外的活性监测本研究应用SPIONs标记的细胞生长培养基(CytokineGrowthMedium，CGM)，标记浓度分别为3．5、7、14和28gg／ml，细胞标记采用单次SPIONs标记法。培养的细胞分别于标记后第1、2、4和7d收获，各时间点获得的细胞分为五组，分别行MTT法、普鲁氏蓝染色和流式细胞仪检测；无SPIONs标记的细胞生长培养基组作为对照组。3．羊膜问充质干细胞的标记分别采用不同浓度的Brdu、DAPI和SPIONs标记原代培养的人羊膜间充质干

8、细胞，确定较好的羊膜间充质干细胞标记途径和方法，为羊膜间充质干细胞移植治疗角膜碱烧伤的活体示踪进行前期准备。4．羊膜间充质干细胞移植对重度角膜碱烧伤的疗效待移植细胞的制备：应用浓度为14gg／mlSPIONs标记原代培养获取的羊膜间充质干细胞，标记时间24h，收集细胞制成1x106细胞混悬液备用。实验动物分组和细胞移植的方法：动物被随机分成四组，对照组(n=