大鼠间充质干细胞磁标记与肝脏移植后的mr活体示踪

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1、华中科技大学同济医学院2003级博士学位论文前言干细胞具有无限增殖及多向分化等潜能，通过干细胞移植可以使其增殖、替代病损细胞，从而达到修复器官解剖和功能的目的。近年来，随着干细胞研究的不断深入，干细胞移植已经在多种疾病的治疗中显示出巨大的潜力和广阔的应用前景。在干细胞移植的研究中，标记及示踪技术一直是研究热点之一。对干细胞移植的示踪有助于了解供体细胞在受体内的分布、迁徙、分化及转归等生物学行为，这对评估干细胞移植的效果以及提供干细胞移植疗法的最优化信息具有重要意义。传统的干细胞示踪多采用以下方法：①基因标记：即通过改变细胞的遗传基因，使之表达特异性蛋白标志物，如绿色荧光

2、蛋白(GFP)基因可表达GFP，LacZ基因可表达B．半乳糖苷酶等。②核酸标记：在细胞有丝分裂过程中将某种物质合成于DNA链内，如3H胸腺嘧啶(3H—Tdr)、5一溴脱氧尿营(BrdU)等。③荧光染料标记：如联脒二苯吲哚(DAPI)、碳花青(DiD等。④利用染色体或其它特异性酶、抗原等作标志物：如采用雄性(或二肽基肽酶IV+)供体细胞移植入雌性(或二肽基肽酶IV一)受体，通过组化方法检测。上述标记及示踪方法存在一个共同的缺陷，即只能在离体状态下通过组织病理学分析来实现，这显然不符合干细胞移植未来临床应用的需要。随着干细胞研究的不断进展，建立一种无创、有效的活体示踪技术已

3、经势在必行，而分子影像学的发展为解决这一问题提供了可能。分子影像学是将活体动物及人类复杂的生理病理过程在细胞或分子水平上变成直观的图像，从而向我们提供传统影像学无法得到的细胞或分子水平的信息。根据成像方法不同，分子影像学主要包括核素分子成像(PET)、MR分子成像、光学分子成像等，其中，MR因其较高的空间分辨率而在干细胞活体示踪的研究中备受瞩目。有关干细胞磁标记及MR活体示踪的研究，国内外部分学者已进行了有益的尝试并取得初步成功。早期研究多采用高场强MR系统进行单个细胞成像，近年华中科技大学同济医学院2003级博士学位论文来，随着标记方法的不断改进和标记效率的明显提高，

4、也有研究应用1．5TMR成功地进行了磁标记干细胞的体外成像及活体示踪。磁标记干细胞的MR活体示踪研究目前多局限于中枢神经系统和心脏等领域。无论在心脏，还是大脑和脊髓，研究者均发现了磁标记干细胞移植部位MR信号的改变，并显示了信号改变区域与病理检测结果的一致性。这些研究多采用局部点注射方式将磁标记干细胞移植入实体组织，使干细胞得以在组织局部形成较高的浓度。然而，在干细胞移植的实际应用中，点注射移植方式只能用于某些局部病变的治疗，对于弥漫性或系统性病变，干细胞治疗以血管注射方式移植似乎更为合理。经血管注射移植后，磁标记干细胞在组织器官内呈弥散分布，且有随血流迁移至靶器官以外

5、的可能，此种情况下MR示踪方式及其效果如何?这正是干细胞移植MR活体示踪研究中急需解决的问题，也是目前该领域的研究热点之一。干细胞移植对终末期肝病的治疗作用已在许多动物试验中证实，而且干细胞还具有作为基因载体用于肝癌或某些先天性遗传性肝病基因治疗的潜力。随着肝脏干细胞移植研究的不断进展，利用MR进行肝脏干细胞移植的活体示踪也就越发必要和迫切。本课题拟采用超顺磁性氧化铁纳米微粒标记大鼠骨髓间充质干细胞(肝脏干细胞的来源之一)，并通过制作大鼠急性肝损伤模型，将磁标记干细胞经门静脉途径植入大鼠肝内，利用1．5T临床应用型MR成像系统进行磁标记干细胞移植后的动态MR成像及相关病

6、理学检测，观察细胞植入前后Mm信号有无变化及变化规律，并与病理结果对照，探讨MR活体显示磁标记干细胞的可行性，从而为肝脏干细胞移植提供一种无创、有效的活体示踪技术。华中科技大学同济医学院2003级博士学位论文大鼠间充质干细胞磁标记及肝脏移植后的MR活体示踪华中科技大学同济医学院附属协和医院放射科博士研究生：蔡金华导师：冯敢生教授摘要第一部分大鼠间充质干细胞的分离、培养及生物学特性目的建立大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分离及体外扩增的方法，并了解其生物学特性，为应用MSCs进行进一步研究奠定基础。方法取Wistar大鼠双侧股骨及胫骨，冲洗骨髓腔获得骨髓全系细胞，离心后重

7、悬于含10％胎牛血清的5m1D肛M／F12培养基，置37。C、5％CO。饱合湿度培养箱中，利用贴壁法培养、纯化MSCs。接种后第3d全量换液，以后每2d换液1次，至贴壁细胞逐渐铺满瓶底时，传代扩增。倒置显微镜下观察细胞形态。分别取生长良好的P。、P。、P5代细胞绘制生长曲线，并进行贴壁率的检测。方差分析检验三代细胞生长性状及贴壁特性差异。结果(1)原代细胞生长较慢，以克隆集落方式增殖，培养早期细胞表现为短梭形、三角形或星形等多种形态。之后，细胞集落逐渐融合，细胞形态也渐趋均一，呈长梭形或纤维状。至第12～14d，细胞已基本融合，形态均一，