羊膜移植促进兔角膜碱烧伤愈合的作用

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1、羊膜移植促进兔角膜碱烧伤愈合的作用【摘要】目的观察羊膜移植(AMT)在兔角膜碱烧伤早期对角膜上皮愈合、角膜炎症反应和新生血管生成的影响。方法新西兰白兔建立角膜碱烧伤模型,烧伤后30min实施手术，随机分为碱烧伤组(A)、新鲜羊膜移植组(fAMT)、保存羊膜移植组(pAMT)，设对照组(C)。病理组织学观察角膜,计算机图像分析系统计数角膜多形核中性白细胞(PMN)和微血管数量,发色底物法检测角膜组织浸液中组织型纤溶酶原激活剂(tPA)和1型纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI1)活性。结果fAMT和pAMT组较A

2、组同期角膜上皮修复快，角膜PMN数及微血管数量明显减少(P<0.01)，tPA/PAI1显著下降(P<0.01)；fAMT组tPA/PAI1低于pAMT组(P<0.05)。结论羊膜移植在角膜碱烧伤早期治疗中具有较强的促进上皮修复、减轻炎症反应和减少新生血管生成的作用。新鲜羊膜移植效果优于保存羊膜。【关键词】羊膜角膜烧伤化学碱类眼烧伤羊膜位于胎盘最内层,无血管、神经和淋巴,光滑而有弹性,是人体最厚的基底膜。近年来,人们发现羊膜具有抑制炎症、新生血管生成及促进上皮细胞修复重建眼表的作用

3、。笔者通过建立兔角膜碱烧伤模型,分析羊膜移植促进角膜碱烧伤愈合的作用,为临床治疗角膜化学烧伤等疾病提供理论依据。1材料与方法1.1材料1.1.1动物及分组新西兰白兔60只,体质量(2.3±0.18)kg,雌雄不限,健康无眼病[无锡市惠山江南实验动物场提供,许可证号:SCXK(苏)20020006]。随机分成碱烧伤组(A)、新鲜羊膜移植组(fAMT)、保存羊膜移植组(pAMT)及对照组(C)。模型组每组18只,对照组6只,右眼为实验眼。1.1.2仪器与试剂眼科显微手术器械(江苏省康明医疗器械有限公司),手术

4、双目显微镜、显微镜(日本Olympus公司),摄像机(日本Panasonic公司),彩色图像分析仪(Image8000，澳大利亚),ImagePlus5.0图像分析软件,低温冰箱(德国Siemens公司),匀浆器(美国etertech公司),tPA及总PAI1活性测定试剂盒(上海太阳生物技术公司)。1.2方法1.2.1兔角膜碱烧伤模型制备1%戊巴比妥钠40mg/kg兔耳缘静脉麻醉,1%的卡因眼液滴右眼表面麻醉,置开睑器,直径8mm圆形单层滤纸片置于1mol/LNaOH溶液浸至饱和，取出置兔角膜中央1mi

5、n,使角膜达到Ⅳ度烧伤[1]。立即用生理盐水100mL冲洗结膜囊。氯霉素眼液及阿托品眼液滴眼。fAMT组和pATM组30min后手术。1.2.2羊膜制备羊膜均取自产前血清学检查HIV、HBV、HCV及梅毒螺旋体均阴性的健康产妇剖宫产的胎盘。无菌条件下生理盐水冲洗胎盘表面血迹,浸泡于含5×104U/L青霉素、5×104U/L链霉素和2.5mg/L两性霉素B的无菌生理盐水10min。fAMT组:从绒毛膜上钝性分离羊膜,上皮面向上平铺于粘贴手术巾的纸片上,剪成4.0cm×4.0cm,4℃保存于无菌DMEM液中,1

6、2h内使用。pAMT组:羊膜置于装有无菌DMEM与100%甘油(1∶1混合)的无菌瓶中,-80℃冻存。1.2.3羊膜移植解冻取出羊膜,在含40万U/L庆大霉素的无菌生理盐水中复温30min。沿角膜缘360°环形剪开球结膜,将备好的新鲜或保存的羊膜片剪成直径18mm圆形,上皮面朝上平铺于角膜表面,边缘超出角膜缘2mm,用80无损伤缝线间断缝合固定于浅层巩膜,使羊膜紧帖角膜创面,剪去多余的羊膜,结膜缝回角膜缘。术后结膜囊涂金霉素眼膏,每日滴氯霉素眼液2次,涂1%阿托品眼膏及金霉素眼膏各1次。1.2.4标本制备

7、分别于角膜碱烧伤后14,30,60d各组随机取6只兔,处死后取下角膜,用4%多聚甲醛固定24h,常规病理制片,片厚4μm,每隔5张A:碱烧伤组;B:保存羊膜移植组;C:新鲜羊膜移植组.图1角膜碱烧伤后第14天和第60天碱烧伤组和羊膜移植组的角膜(HE染色×400)Fig1Cornealappearanceofalkaliburngroupandamnioticmembranetransplantationinthe14thand30thdaysafteralkaliburn(HEstain×400)取1

8、张,HE染色,光镜观察。1.2.5多形核中性白细胞(PMN)计数每只角膜取3张切片显微镜观察,从周边到中央随机选取10个低倍视野(×100),彩色图像分析仪读取图像,图像分析软件行PMN计数,取均值。1.2.6微血管数观察每只角膜选3张HE切片,每张切片任选10个高倍视野(×400),应用图像分析软件计算每个视野下新生血管横断面数目,以管腔完整为准,管径粗细不计。1.2.7tPA和总PAI1活性测定将解冻