羊膜为载体培养自体口腔粘膜上皮细胞移植治疗兔角膜碱烧伤实验的研究

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1、独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：丑俎签字目期：匝年』月—笪日学位论文版权使用授权书本学位论文作者及指导教师完全了解大连医科大学有关保留、使用学位论文的规定，同意大连医科大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查

2、阅和借阅。本人授权大连医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。论文作者虢叠多盗．指导教师签名：望垒堑．

3、签字日期：2巫年—[月卫f：：_]羊膜为载体培养的自体口腔粘膜上皮细胞移植治疗兔角膜碱烧伤的实验研究硕士研究生：指导教师：指导小组：专业名称：方石峰马翔教授孙洪臣教授眼科学摘要目的：角膜缘干细胞缺损是一组由多种疾病引起，并导致多种严重角膜及眼表变化的眼科疾病。角膜酸碱化学烧伤，热烧伤，Stevens_Johnson综合征，瘢痕性天疱疮等常引起严重的角膜缘干细胞缺损

4、，表现为角膜上皮持续缺损、基质瘢痕、新生血管，最终导致角膜结膜化，不仅损害眼表结构，还严重影响患者的视功能。人们已经尝试多种方法治疗角膜缘干细胞缺损，包括角膜移植、角膜缘干细胞移植等。角膜移植、异体干细胞移植由于排斥反应常导致手术的失败。自体角膜缘干细胞移植由于不会发生排斥反应是治疗干细胞缺损的最佳治疗方案，但角膜缘干细胞缺损的患者常为双眼同时患病，干细胞来源有限，且手术对供眼存在潜在的危险，限制了其在临床上的应用。因此我们将取自兔自体的口腔粘膜上皮细胞进行体外培养增殖，代替来源有限的角膜缘干细胞，并以羊膜为载体移植治疗兔角膜碱烧伤所致的角膜

5、缘干细胞缺损，通过与单纯去上皮羊膜移植比较治疗效果，探讨该术式的安全性和有效陛，为严重知膜p干细胞缺损的临床治疗提供实验依据。方法：21只新西兰兔(2—2．5蚝)麻醉后，每只选1眼无菌条件下lrnol几NaOH溶液接触lmh建立角膜碱烧伤动物模型。羊膜经EDTA处理后去除其上皮细胞。口腔粘膜上皮组织r4_6mm2)从兔口腔获取，将组织块置37℃培养箱30jⅢn，经1．259／L崩酶0．29／LEDTA混台液消化分离、收集细胞。对收集的细胞进行原代培养，采用含10％胎牛血清的DMEM培养液(pH7．4)。当培养细胞达到80％～90％融合时进行消

6、化传代，绘制细胞生长曲线，按l×103个细胞／mm2面积接种于铺有羊膜的培养皿中，进行气．液培养(airlifting)，细胞培养2．3周后形成5．6层复层上皮后行移植手术。将碱烧伤角膜缘干细胞缺损模型兔21只随机分为对照组(controlgroup)，单纯羊膜移植组(AMgroup)和口腔粘膜上皮细胞羊膜移植组(AM+cellgmup)，每组7只兔子7只眼，单纯羊膜移植组和口腔粘膜上皮细胞羊膜移植组眼烧伤后第7天行移植手术，并对治疗后的角膜进行裂隙灯观察、病理学及免疫组织化学检查。结果：羊膜为载体进行气一液培养的兔口腔粘膜上皮细胞经2．3周

7、形成5—6层的复层上皮，分化良好，且与正常角膜上皮细胞相似。口腔粘膜上皮细胞羊膜移植治疗后兔角膜基本保持透明，无结膜上皮进入，新生血管细小；病理学检查可见与正常角膜类似的复层上皮，上皮细胞，排列整齐，与基质层连接紧密，偶可见炎细胞，未见明显杯状细胞和新生血管；AE．1染色阳性。单纯去上皮羊膜移植治疗后角膜混浊，新生血管向角膜中央生长，角膜表面可见结膜上皮长入；病理学检查可见排列不规则的复层上皮细胞，夹杂杯状细胞，其下基质可见炎细胞、红细胞和新生血管AE．1染色弱阳性。对照组大部分角膜上皮脱落、基质纤维肿胀、变性、变薄、炎细胞浸润、大量新生血管

8、长入。结论：在实验中我们将兔自体口腔粘膜上皮细胞进行体外培养，并以羊膜为载体移植到碱烧伤干细胞严重缺损的眼表，与单纯羊膜移植组比较，发现术后早期即可恢复角膜上皮结构的完整性，抑制角膜新生血管的形成，为严重干细胞缺损眼表疾病的治疗提供了一条新途径。由此推测可以将人自体口腔粘膜上皮细胞体外培养增殖、移植进行眼表重建，从而治疗由于各种原因引起的人角膜缘干细胞缺损。但是上述治疗的远期疗效，口腔粘膜上皮细胞中是否存在于细胞等问题尚有待于进一步研究。培养关键词：角膜缘干细胞口腔粘膜上皮细胞羊膜眼表重建细胞T}ansplantationofCultiVat

9、edAutologousOralMucosalEpitheIiaICellsonAmnioticMembraneInRabbitsWithCornealAlI诳Ii