羊膜移植促进兔角膜碱烧伤愈合的作用论文

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1、羊膜移植促进兔角膜碱烧伤愈合的作用论文【摘要】目的观察羊膜移植(AMT)在兔角膜碱烧伤早期对角膜上皮愈合、角膜炎症反应和新生血管生成的影响。方法新西兰白兔建立角膜碱烧伤模型,烧伤后30min实施手术.freelpus公司),摄像机(日本Panasonic公司),彩色图像分析仪(Image8000，澳大利亚),ImagePlus5.0图像分析软件,低温冰箱(德国Siemens公司),匀浆器(美国etertech公司),tPA及总PAI1活性测定试剂盒(上海太阳生物技术公司)。1.2方法1.2.1兔角膜碱烧伤模型制备1%戊巴比妥钠40mg/kg兔耳缘静脉麻醉,1%的卡因眼液滴右眼表面麻醉

2、,置开睑器,直径8mm圆形单层滤纸片置于1mol/LNaOH溶液浸至饱和，取出置兔角膜中央1min,使角膜达到Ⅳ度烧伤1。立即用生理盐水100mL冲洗结膜囊。氯霉素眼液及阿托品眼液滴眼。fAMT组和pATM组30min后手术。1.2.2羊膜制备羊膜均取自产前血清学检查HIV、HBV、HCV及梅毒螺旋体均阴性的健康产妇剖宫产的胎盘。无菌条件下生理盐水冲洗胎盘表面血迹,浸泡于含5×104U/L青霉素、5×104U/L链霉素和2.5mg/L两性霉素B的无菌生理盐水10min。fAMT组:从绒毛膜上钝性分离羊膜,上皮面向上平铺于粘贴手术巾的纸片上,剪成4.0cm×4.0cm,4℃保存于无菌DME

3、M液中,12h内使用。pAMT组:羊膜置于装有无菌DMEM与100%甘油(1∶1混合)的无菌瓶中,-80℃冻存。1.2.3羊膜移植解冻取出羊膜,在含40万U/L庆大霉素的无菌生理盐水中复温30min。沿角膜缘360°环形剪开球结膜,将备好的新鲜或保存的羊膜片剪成直径18mm圆形,上皮面朝上平铺于角膜表面,边缘超出角膜缘2mm,用80无损伤缝线间断缝合固定于浅层巩膜,使羊膜紧帖角膜创面,剪去多余的羊膜,结膜缝回角膜缘。术后结膜囊涂金霉素眼膏,每日滴氯霉素眼液2次,涂1%阿托品眼膏及金霉素眼膏各1次。1.2.4标本制备分别于角膜碱烧伤后14,30,60d各组随机取6只兔,处死后取下角膜,用

4、4%多聚甲醛固定24h,常规病理制片,片厚4μm,每隔5张A:碱烧伤组;B:保存羊膜移植组;C:新鲜羊膜移植组.图1角膜碱烧伤后第14天和第60天碱烧伤组和羊膜移植组的角膜(HE染色×400)Fig1Cornealappearanceofalkaliburngroupandamnioticmembranetransplantationinthe14thand30thdaysafteralkaliburn(HEstain×400)取1张,HE染色,光镜观察。1.2.5多形核中性白细胞(PMN)计数每只角膜取3张切片显微镜观察,从周边到中央随机选取10个低倍视野(×100),彩色图像分

5、析仪读取图像,图像分析软件行PMN计数,取均值。1.2.6微血管数观察每只角膜选3张HE切片,每张切片任选10个高倍视野(×400),应用图像分析软件计算每个视野下新生血管横断面数目,以管腔完整为准,管径粗细不计。1.2.7tPA和总PAI1活性测定将解冻的角膜剪碎,每克湿重组织加入预先冷冻的组织液2mL,含1%TritonX100的0.1mol/LTrisHCl缓冲液,匀浆。4℃,800r/min离心20min,2次,取上清液,冻于-70℃待测。tPA和总PAI1活性采用发色底物法测定。酶标仪于波长405nm测定光密度,标准曲线分析,测定标本tPA及PAI1的活性。1

6、.3统计学处理数据以x±s表示,采用SPSS11.5进行单因素方差分析,两两比较采用LSDt检验方法,用于比较各组在同一时间上的差别,α=0.05为检验水准。2结果2.1病理组织学碱烧伤后14d,A组角膜上皮层薄,排列紊乱,且部分缺失,基质水肿,板层纤维断裂溶解,基质全层特别是坏死区、近溃疡区及邻近溃疡的上皮细胞下可见大量炎症细胞浸润,基质大量新生血管。pAMT组已形成单层上皮,但形状欠规则,排列不整齐,上皮下少量炎症细胞浸润,基质中有新生血管。fAMT组上皮细胞排列较整齐,上皮下炎症细胞浸润较少,基质中新生血管较少。碱烧伤后30d,A组上皮细胞增生、排列紊乱,仍有较多的炎症细胞浸润和

7、基质新生血管。pAMT组上皮排列欠规则,可见少许炎症细胞浸润和基质新生血管。fAMT组上皮排列较规则,炎症细胞浸润及基质新生血管较少。烧伤后60d,fAMT和pAMT组角膜上皮生长良好,炎症细胞浸润和新生血管均较A组明显减轻(图1)。2.2PMN碱烧伤后14,30,60dA组与AMT组角膜PMN数见表1。2.3微血管数碱烧伤后14,30,60d,A组与fAMT和pAMT组角膜微血管数见表2。表1兔角膜组织中PMN数密度表2兔角膜组织