外阴阴道假丝酵母菌病的菌种与耐药性研究

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分类号：学校代码：10601密级公开编号：G10014硕士学位论文外阴阴道假丝酵母菌病的菌种与耐药性研究学科专业外科学:普通妇科研究方向:研究生姓名阳华:学号G10014:学位类型科学学位导师姓名姚军教授:二O一三年二月 独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日----------------------------------------------------------------学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解桂林医学院有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权桂林医学院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国学术期刊（光盘版）电子杂志社、中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》、《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导师签字：签字日期：年月日签字日期：年月日II 目录外阴阴道假丝酵母菌病的菌种与耐药性研究……………………………1中文摘要………………………………………………………………1ABSTRACT……………………………………………………………3英汉缩略词对照表……………………………………………………………5前言……………………………………………………………………61资料与方法………………………………………………………61.1对象………………………………………………………………61.2菌种鉴定………………………………………………………………71.3统计学方法……………………………………………………………102结果…………………………………………………………………112.1假丝酵母菌分型结果…………………………………………………112.2药敏分析……………………………………………………………123讨论…………………………………………………………………153.1假丝酵母菌菌种分布……………………………………………………153.2假丝酵母菌的致病机制…………………………………………………163.3假丝酵母菌的耐药机制…………………………………………………173.4药敏试验对治疗的指导意义…………………………………………214结论…………………………………………………………………23参考文献………………………………………………………………………24综述……………………………………………………………………………28攻读学位期间发表的学术论文目录…………………………………………44致谢……………………………………………………………………………45 外阴阴道假丝酵母菌病的菌种与耐药性研究中文摘要目的：外阴阴道假丝酵母菌病（VVC）是常见的妇科感染性疾病，约占微生物所致阴道炎的25.0%-30.0%,复发性外阴阴道假丝酵母菌病(RVVC)，临床治疗颇为棘手。本研究对复发性外阴阴道假丝酵母菌病（RVVC）、外阴阴道假丝酵母菌病（VVC）患者阴道分泌物进行培养、菌种分型及药物敏感试验，探讨其治疗策略。方法：病人来源2005年12月至2008年12月我院妇科门诊患者。RVVC组：共97例，平均年龄32.64±5.89岁；VVC组：共97例，平均年龄28.92±6.41岁。以无菌棉拭子经阴道窥器检取阴道后穹窿分泌物进行真菌培养。分泌物用沙氏培养基35℃培养194例患者阴道TM分泌物,其中RVVC97例，VVC97例。用API32℃假丝酵母菌鉴定板及ATBFUNGUS3药敏板接种，在ATBExpression全自动微生物鉴定仪判读结果。用SPSS12．0统计分析软件进行统计分析。组间差异比较采用卡方检验。结果：在培养检测的194例阴道分泌物中白假丝酵母菌156例，占80.41％(156／194)；其他非白假丝酵母菌38例，占19.59%。RVVC组中73例为白假丝酵母菌，占75.26％(73／97)，VVC组中83例为白假丝酵母菌，占85.57％(83／97)。RVVC组非白假丝酵母菌比例高，与VVC组比较差异有统计学意义(P<0．05)。RVVC组假丝酵母菌对氟康唑药物敏感率（68.04%）低于VVC组（86.60%）(P<0．05)。非白假丝酵母菌对氟康唑药物敏感率(60.53%)低于白假丝酵母菌（81.41%）。假丝酵母菌对药物的敏感性由弱到强依次为：氟康唑、氟胞嘧啶、伏立康唑、伊曲康唑、两性霉素B。结论：VVC、RVVC的主要致病菌仍是白假丝酵母菌，RVVC组非白假丝酵母菌比例高于VVC组,非白假丝酵母菌中仍以光滑假丝酵母菌最为多见；唑类药物中伊曲康唑敏感性最高，是治疗VVC时唑类药物中的首选；RVVC组假丝酵母1 菌对氟康唑的敏感性明显低于VVC组，非白假丝酵母菌对氟康唑的敏感性明显低于白假丝酵母菌。关键词：外阴阴道假丝酵母菌病；复发；菌种分型；药物敏感性试验2 ResearchonStrainandDrugtoleranceofVulvovaginalCandidiasisABSTRACTObjective:Vulvovaginalcandidiasis(VVC)iscommoninobstetricsandgynecologyinfectiousdiseases,accountingformicrobialvaginitiscaused25.0%to30.0%,withrecurrentvulvovaginalcandidiasis(RVVC),clinicaltreatmentratheristricky.Thestudytoprobethestrategiesoftreatmentforrecurrentvulvovagnialcandidiasis(RVVC)andvulvovagnialcandidiasis(VVC),typingofthestrainandthedrugsensitivetest.Methods：2005Decemberto2008Decemberpatientsfromgynecologicalout-patientofourhospital.GroupRVVC:atotalof97patients,meanage32.64±5.89yearsold;groupVVC:atotalof97patients,meanage28.92±6.41yearsold.Usingsterilecottonswabandvaginalspeculumtakeingvaginalfornixsecretionsforfungalculture.Thevaginaldischargesof194patientswerecultivatedwith35℃Sabouraud’smedium,amongthemtherewere97patientswithRVVC,and97patientswithVVC.ThesampleswereinoculatedinAPITM32℃candidakruseiidentificationboardandATBFUNGUS3drugsensitiveboard.TheresultswereanalyzedbyATBExpressionautomaticmicrobiologicalassayapparatus.StatisticalanalysisusingSPSS12.0softwareforstatisticalanalysis.Thedifferencebetweenthegroupscomparedusingthechi-squaretest.3 Results:Amongthecultivatedvaginaldischargein194patients,156patientswerewithcandidaalbicans,accountingfor80.41％(156／194);38patientswerewithnon-candidaalbicans,accountingfor19.59％.InRVVCgrouptherewere73patientswithcandidaalbicansaccountingfor75.26％(73／97),inVVCgrouptherewere83patientswithcandidaalbicansaccountingfor85.57％(83／97).InRVVCgrouptheproportionofnon-candidaalbicanswashighthanthatinVVCgroup，andthereweresignificantdifference(P<0.05).InRVVCgroupthesensitiverateofcandidakruseitofluconazolewaslowerthanthatinVVCgroup(P<0.05).Non-candidaalbicanstofluconazolesusceptibilityrate(60.53%)lowerthanCandidaalbicans(81.41%).Sensitivitytocandidadrugfromweaktostrongisasfollows:fluconazole,flucytosine,voriconazole,itraconazole,amphotericinB.Conclusion:ThemainpathogenicbacteriaofVVCandRVVCiscandidaalbicans.InRVVCgrouptheproportionofnon-candidaalbicansishigherthanthatinVVCgroup.Thesmoothcandidawasthemostcommoninnon-candidaalbicans.Itraconazolehasthehighestsusceptibilityintheazoles，isthefirstchoiceofazoledrugsinthetreatmentofVVC.InRVVCgroupthesensitiverateofcandidakruseitofluconazoleissignificantlylowerthanthatinVVCgroup,andthesensitiverateofnonCandidaalbicanstofluconazoleissignificantlylowerthanthatofCandidaalbicans.KeyWords:Vulvovaginalcandidiasis;Recidivation;Typingofstrain；Drugsensitivetest4 英汉缩略词对照表英文缩写英文全称中文全称外阴阴道假丝酵母VVCvulvovaginalcandidiasis菌病Recurrentvulvovaginalcandidiasis复发性外阴阴道假RVVC丝酵母菌病heatshockprotein90HSP90热休克蛋白90extracellularmatrixECM细胞外基质5-fluorocytosineFc５-氟胞嘧啶AmphotericinBAMB两性霉素B5 前言外阴阴道假丝酵母菌病(VVC)是常见的妇产科感染性疾病，约占微生物[1]所致阴道炎的25.0%～30.0%，VVC的主要临床表现有外阴瘙痒、灼痛难忍、阴道分泌物增多，并伴有泌尿系症状及性生活不适等。妇科检查可见外阴阴道水肿、潮红、并见明显抓痕，阴道分泌物呈豆渣样、凝乳状附着于外阴及阴道粘膜，用棉拭子擦除后可见潮红或破损的阴道粘膜。VVC的局部症状强烈且易于复发，患者常常以外阴瘙痒难忍就诊。VVC的诊治规范中把其分为单纯性及复杂性两种类型。单纯性VVC指的是宿主为正常非孕、由白假丝酵母菌所致的症状轻或者中度VVC及散发VVC。复杂性VVC则包括以下几类:重度或复发性VVC、妊娠期VVC、非白假丝酵母VVC或者宿主为应用免疫抑制剂者、免疫低下者、未控制的糖尿病患者。复发性VVC是[2]指一年内有症状性VVC发作四次或四次以上。重度VVC指临床症状严重者，其外阴或者阴道皮肤黏膜有破损，按VVC的评分标准，评分大于或等于7分者为重度VVC。近年来,VVC的发病率有明显上升趋势,成为育龄期妇女发病率较高的一种妇科炎症,75%的女性一生中至少会有一次患VVC,40%-50%［3］的VVC病人有会再次发作，发展为RVVC的病人约5％-10%，近年来许多抗真菌药物广泛应用于临床，假丝酵母菌耐药菌株逐渐增多，耐药率增高,临床治疗颇为棘手,为此，我们进行了VVC和RVVC的菌种鉴定和耐药性研究，以期为临床治疗提供依据和帮助。1资料与方法1．1对象2005年12月至2008年12月我院妇科门诊患者。RVVC组：共97例，平均年龄32．64±5.89岁；VVC组：共97例，平均年龄28.92±6.41岁。以无菌6 棉拭子经阴道窥器检取阴道后穹隆分泌物置于无菌试管内，送检验科进行真菌培养。1．2菌种鉴定及药敏试验将分泌物接种于沙氏培养基35℃培养，若出现酵母样菌落，经涂片革兰染色镜检为酵母样真菌后，用法国生物-梅里埃公司提供的API32℃假丝TM酵母菌鉴定板及ATBFUNGUS3药敏板按其说明书接种，35℃培养，在ATBExpression全自动微生物鉴定仪判读结果。真菌培养基由英国OXOID公司提供。Vitek细菌鉴定及药敏分析系统由法国生物-梅里埃公司提供。具体方法：1.分区划线、分离菌种从冰箱内取出血琼脂平板，待室温平衡后待用。手斜持琼脂平板，皿盖留在桌上，于火焰近处取附有标本的棉拭子在平板上端涂抹成薄膜作为第一区（如为液体状标本则用接种环取一环涂划成薄膜）（约占平板总表面积的1/10）。右手持接种环，经火焰灭菌，待凉后，从薄膜处取菌作连续平行划线，约占平板表面1/5左右，再次烧灼接种环，等三次平行划线……以同样方法作第四次，第五次划线，将平板表面划完。2.孵育培养划线完毕，盖上平皿盖，底面向上，用标签或腊笔注明标识（如编号等），置35℃孵育培养24小时后观察结果。如图1。7 图１分区划线、分离菌种、孵育培养3.观察结果从孵育取出平板，观察琼脂表面是否有肉眼可见菌落，如有菌落则涂片，经革兰染色后在显微镜下观察形态。4.涂片、革兰染色、镜检方法（1）涂片：左手持菌液试管，右手持接种环，用接种环从试管培养液中取一环菌，从酒精灯外焰穿过，于载玻片中央涂成薄层（事先在背面做好标记圆圈）即可，或先滴一小滴无菌水于载玻片中央，用接种环从斜面上挑出少许，与载玻片上的水滴混合均匀，涂成一薄层。（2）干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠近火焰。（3）固定：常用高温进行固定。即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3～4次，共约3～4秒。要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色。8 （4）染色：初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。脱色：将载玻片上的水甩净，并衬以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20～30秒，立即用水冲净酒精。复染：用番红液染1～2分钟，水洗。（5）镜检：干燥后，置油镜观察。真菌呈紫色，卵圆形孢子形态。图２、3。图２涂片染色后镜检9 图3涂片染色后镜检5．鉴定先用无菌生理盐水配制0.5麦氏单位菌液，在ID32C酵母菌鉴定系统条(法国生物梅里埃公司)内每孔加1滴菌液，盖好盖子，放湿盒内35℃24小时。6.药物敏感性试验先用无菌生理盐水配制0.5麦氏单位菌液，在ATBFUNGUS真菌药敏试验系统条(法国生物梅里埃公司)内每孔加1滴菌液，盖好盖子，放湿盒内35℃24小时。7.判读鉴定及药敏结果用ATBExpression自动化细菌鉴定及药敏分析系统(法国生物梅里埃公司)进行测试。1．3统计学方法实验资料以WindowsExcel软件建立数据库，应用SPSS12.0统计软件进行数据处理。计量资料数据采用x±s表示，非正态分布的数据先进行自然对数转换，使其符合正态分布后再进行比较。根据ANOVA表比较各指标在组10 间是否有显著性差异，以P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有显著统计学意义。各组指标的比较用方差分析，方差齐则用LSD进行两两比较，方差不齐则用GamesHowell进行两两比较。2结果2．1假丝酵母菌分型结果在培养检测的194例阴道分泌物中白假丝酵母菌156例，占80.41％(156／194)；其他非白白假丝酵母菌38例，占19.59%。RVVC组中73例为白假丝酵母菌，占75.26％(73／97)，VVC组中83例为白假丝酵母菌，占85.57％(83／97)。RVVC组非白假丝酵母菌比例高，与VVC组比较差异有统计学意义(P<0．05)。见表1。表1假丝酵母菌分型结果n(%)Tab1Strainofcandidakrusein(%)菌种RVVC组VVC组合计白假丝酵母菌73(75.26)83(85.57)156光滑假丝酵母菌18(18.56)13(13.4)31热带假丝酵母菌3（3.09）1（1.03）4克柔假丝酵母菌2（2.06）02其它假丝酵母菌1（1.03）01合计9797194白假丝酵母菌光滑假丝酵母菌热带假丝酵母菌克柔假丝酵母菌其他假丝酵母菌图1假丝酵母菌分型结果11 2．2药敏分析2．2．1194例假丝酵母菌药敏试验结果见表2。假丝酵母菌对氟康唑、5-氟胞嘧啶、伏立康唑、伊曲康唑、两性霉素B的高度敏感率分别为77.32%、79.90%、80.93%、90.72%、97.42%，中度敏感率分别为15.46%、7.22%、12.89%、4.64%、2.58%，耐药率分别为7.22%、12.89%、6.19%、4.64%、0。表2假丝酵母菌药敏试验结果n(%)Tab2Drugsensitivetestresultofcandidakrusein(%)药物高敏中敏耐药氟胞嘧啶155（79.90）14（7.22）25（12.89）两性霉素B189（97.42）5（2.58）0伏立康唑157（80.93）25（12.89）12（6.19）伊曲康唑176（90.72）9（4.64）9（4.64）氟康唑150（77.32）30（15.46）14（7.22）100908070氟胞嘧啶60两性霉素B50伏立康唑40伊曲康唑30氟康唑20100高敏中敏耐药图1假丝酵母菌药敏试验结果12 2．2．2RVVC组与VVC组假丝酵母菌药敏试验结果RVVC组假丝酵母菌对氟康唑药物敏感率（68.04%）低于VVC组（86.60%）,差异有统计学意义(P<0．05),见表3。非白假丝酵母菌对氟康唑药物敏感率(60.53%)低于白假丝酵母菌（81.41%）,见表4。表3RVVC组与VVC组假丝酵母菌药敏试验结果n(%)Tab3DrugsensitivetestresultofcandidakruseiinRVVCandVVCgroupn(%)RVVC组(n=97)VVC组(n=97)药物P高敏n(%)中敏（n）耐药（n）高敏n(%)中敏（n）耐药（n）氟胞嘧啶77（79.38）61478（80.41）811＞0.05两性霉素B93（95.88）4096（98.97）10＞0.05伏立康唑78（80.41）13679（81.44）126＞0.05伊曲康唑87（89.69）5589（91.75）44＞0.05氟康唑60（68.04）181984（86.60）121＜0.05表4白假丝酵母菌与非白假丝酵母菌药敏试验结果n(%)Tab4Drugsensitivetestresultofcandidaalbicansandnon-candidaalbicansn(%)白假丝酵母菌（n=156）非白假丝酵母菌（n=38）药物P高敏n(%)中敏（n）耐药（n）高敏n(%)中敏（n）耐药（n）氟胞嘧啶125（80.13）101130（78.95）414＞0.05两性霉素B154（98.72）2035（92.11）30＞0.05伏立康唑128（80.25）9229(76.32)1610＞0.05伊曲康唑142(91.03)3134(89.47)68＞0.05氟康唑127（81.41）10323(60.53)2011＜0.0513 10090807060RVVC50VVC403020100氟胞嘧啶两性霉素B伏立康唑伊曲康唑氟康唑图2RVVC组与VVC组假丝酵母菌对抗真菌药物高敏对比90807060RVVC50VVC403020100高敏中敏耐药图3RVVC组与VVC组的氟康唑药敏试验对比14 9080706050白假丝酵母菌40非白假丝酵母菌3020100高敏中敏耐药图4白色假丝酵母菌与非白色假丝酵母对氟康唑的药敏结果对比3讨论3．1假丝酵母菌菌种分布假丝酵母菌属有163种酵母菌，常见的菌种为白假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、都柏林假丝酵母菌、高里假丝酵母菌等。10%～30%非孕妇女及30%妊娠妇女阴道中有此菌寄生,酸性环境适宜其生长，当阴道微生态平衡失调,阴道内优势菌群乳酸杆菌大量减少而假丝酵母菌在阴道内大量繁殖时即导致炎症，故它属条件致病菌。假丝酵母菌中最为常见的为白假丝酵母菌，其为双相菌，革兰染色阳性，正常情况下一般为酵母相，致病时转化为菌丝相，粘附于宿主上皮细胞，菌丝形成，分泌侵袭性酶类，引起炎症反应。近年的文献报道，有症状性VVC中分离的菌株85％～90％为白假丝酵母菌，其余10％～2O％为非白假丝酵母[4]菌，非白假丝酵母菌中以光滑假丝酵母菌为最常见。有学者通过回顾性研究发现，在VVC中非白假丝酵母菌比例由1988年的9.9％上升到1995年的15 17.2％。且10.0%～2O.0%的RVVC患者可检出光滑假丝酵母菌和其他假丝酵[5,6]母菌。本研究结果显示，RVVC组的主要病原菌是白假丝酵母菌,占75.26%，其他非白假丝酵母菌占24.74%(其中光滑假丝酵母菌18例占18.56%)，也[5]与国内朱宇宁等的报道相似。光滑假丝酵母菌的检出率增高，可能与临床唑类药物的广泛应用或治疗不规范诱导白假丝酵母菌向光滑假丝酵母菌变迁有关。3.2假丝酵母菌致病机制目前大多数研究者认为假丝酵母菌致病机制包括以下几方面：一、定植与入侵：假丝酵母菌在阴道粘膜的定植和入侵是其致病的基础，而定植的关键就是粘附，粘附的机理可能是通过假丝酵母菌细胞膜表面甘露糖蛋[8]白的介导形成了与阴道上皮细胞的粘附过程。二、菌丝的形成：有研究发[9]现菌丝形成是外阴阴道假丝酵母菌病的一个主要的致病因素。菌丝是假丝酵母菌粘附于粘膜表面和其侵入组织能力的要素。有学者在电子显微镜下观察在体或离体的标本,发现白假丝酵母菌的菌丝形成后就能穿入深层组[10]织或上皮细胞基质。一些动物实验发现，如果改变某些基因使白假丝酵母菌不能形成菌丝，这种突变株便出现致病力的下降或丧失。有研究证实,白色假丝酵母菌各种毒力因子表达的关键是菌丝的形成,菌丝的形成使致病菌菌株毒力增加,并且感染性增强。而白色假丝酵母菌与非白色假丝酵母[11]菌比较，白色假丝酵母菌对阴道上皮的粘附能力更强,所以在RVVC、VVC的致病菌中白假丝酵母菌比较多见。假丝酵母菌菌体引起症状的原因是其激活了补体旁路途径,从而产生补体趋化因子和过敏毒素,导致阴道粘膜水肿和炎性细胞浸润,炎症部位巨噬细胞释放的溶酶体酶类可导致局部粘膜及皮肤损伤。三、侵袭性酶类的作用:我们发现有一部分假丝酵母菌携带者并没有临床症状，而在有症状的那一部分患者中发现一种分泌型天冬氨酸蛋白酶(SAP)明显增高，两者比较有显著性差异，说明假丝酵母菌的致病症状也就是侵袭性与SPA有关。分泌型天冬氨酸蛋白酶是一种蛋白水解酶,16 其他的蛋白水解酶还有如碱性磷酸酶,磷脂酶等，而SAP类被认为是VVC及RVVC的重要毒力因子,它的家族基因的表达是假丝酵母菌感染的具有特征性的表象,有学者发现白假丝酵母菌能够侵入组织并在宿主体内扩散是由于分泌型天冬氨酸蛋白酶裂解了宿主细胞的各种蛋白,其中作用较为显著[12][13]是SAP2。细胞外磷脂酶也是假丝酵母菌致病的主要因素，有学者研究了阴道分泌物中的假丝酵母菌在不同温度下分解蛋白和脂肪的情况发现，有症状的外阴阴道假丝酵母菌病的患者所带的菌株具有很强的分解蛋白质和脂肪的能力，而无症状的患者却没有此特性。目前发现的白色假丝酵母菌细胞外磷脂酶有A、B、C、D四种，其致病的主要机制可能在于对宿主细胞的损伤和水解,磷脂酶B主要是在白念珠菌入侵宿主的早期对上皮细胞产生粘附、入侵和损伤；而白念珠菌表型转换和信息传递与磷脂酶C和磷脂酶D与有关。3.3假丝酵母菌的耐药机制假丝酵母菌菌种自身存在变异导致耐药菌株的产生,针对连续发作RVVC感染菌株间的相似性，根据DNA指纹图谱技术研究发现假丝酵母菌菌种存在亚株漂移(即同一菌株,但其基因发生细微变)、菌株基因稳定不变、及菌种基因发生替代三种情况。其中“亚株漂移”使细胞的可塑性发生了改变,增加了假丝酵母菌对组织穿透力并增强了假丝酵母菌对抗真菌因子的抵抗力,并使其逃避机体的免疫系统而致病；而耐药菌株的发生源于基因[14,15]替代。有学者的基因分析研究认为，RVVC是由单一基因型酵母菌导致的,但是在抗真菌药物的选择作用下,其基因型却可发生选择性的变异或者完全被不相关基因代替。此外，mdr基因mRNA水平上调可导致白假丝酵母菌对氟康唑的耐药,通常是由mdrl基因翻译的蛋白转运体将多重药物外排泵。膜转运蛋白Mdrp由mdr基因编码,有害物质被转运蛋白依赖跨膜质子梯度往细胞外泵出。耐[16]mdr基因存在于许多原核生物中。Wirsching在对一临床分离的mdrl基因17 R过度表达的氟康哇耐药株的研究中,用MPA-FIipping方法连续敲除mdrl的两个等位基因。该研究发现氟康唑耐药与mdrl基因的过度表达有关,而酮康哇与mdrl基因的过度表达无关,且Mdrp底物具有一定的特异性。绝大部分高度耐氟康唑的假丝酵母菌均存在mdrl基因的过度表达,在氟康唑耐药菌中，靶酶基因ergll表达上调的比率为60%，基因外排泵基因cdrl表达上调的比率分别为40%；己有研究证实，cdrl基因将多种唑类药物泵出细[17、18]胞外,而mdrl基因只特异将氟康唑外排。有研究报道，氟康唑FC30耐药株mdrl基因表达上调倍数是敏感株的2.3倍,表明菌株的耐药程度与[19]mdrl基因的表达相关。此外，有研究表明,Fc3O耐药株存在外排泵mdrl基因过表达导致耐药的机制。两种菌株的ergll基因mRNA表达量相当,提示耐药菌靶酶基因表达量并没有上调,只是出现耐药相关基因突变。细胞内药物累积量下降是多数假丝酵母菌耐药的主要原因,多种外排泵基因过度表达导致这一变化,因此，外排泵将有望成为的抗真菌治疗的新靶点。锌簇转录因子是白假丝酵母菌中某些耐药基因表达的关键调节因子，包括UPC2、TAC1和MRR1等，它们的点突变可引起相应耐药基因的过度表达而造成菌株对唑类药物的敏感性降低。ERG11是唑类药物的作用靶位酶，锌簇转录因子Upc2p可调节ERG11以及ERGl、ERG3、ERG4等其他有关麦角固醇生物合成基因的表达，还是麦角固醇代谢的关键调节因子。UPC2基[20]因的过度表达导致细胞对酮康唑、氟康唑的耐药，相反，它的缺失可以影响细胞在厌氧环境的生长并导致细胞对酮康唑和氟康唑高度敏感。TAC1是第1个被发现的介导白假丝酵母菌耐药基因调控的转录活化因子，是CDRl（白假丝酵母菌耐药蛋白Cdr1p的编码基因）和CDR2（白假丝酵母菌耐药[21]蛋白Cdr2p的编码基因）基因表达上调的必需因子。TAC1点突变与CDRl、[22-24]CDR2的持续性高表达有关，从而导致耐药的发生。TAC1机能亢进的等位基因能引起CDRl、CDR2的持续性高表达，而TAC1野生型的等位基因在[22]诱导剂如氟奋乃静等的存在下也可以引起CDRl、CDR2表达的上调。18 HSP90在靶蛋白的折叠、转运、成熟和降解的过程中起调节作用，是所有真核生物所必须的一种分子伴侣，其通过与底物结合后导致底物接受刺激信号失败进而失活，此外，HSP90也可以在信号介导后协助底物蛋白折叠，帮助复合物的形成和维持复合物的稳定性。研究表明，Hsp90通过快速[25]选择机制介导酿酒酵母菌对氟康唑抗药性的产生。Hsp90能使一系列基因发生突从而导致抗真菌药物耐药性产生，如Erg3突变引起的耐药；Erg3突变体通过改变细胞膜麦角固醇组成，与此同时，避免合成麦角固醇过程中产生的中间毒性产物堆积，即Erg3基因突变后未能生成具有活性的△5，6去饱和酶，从而引起真菌细胞内聚积的固醇中间产物转变为14α-甲基法尼醇（14α-methylfecosterol），其能够部分代替麦角固醇的功能，支持真菌生存，从而使白假丝酵母菌发生耐药而能在含高浓度氟康唑的培养基上生存。而钙调磷酸酶（Calcineurin）是Hsp90底物蛋白，当真菌受刺激时，[26]钙调磷酸酶可调控产生多种反应，其中包括对氟康唑的耐药机制。钙调磷酸酶主要是通过引起Erg3基因突变介导耐药性产生。环孢素A（CsA）是钙调磷酸酶的抑制物，它能与钙调磷酸酶形成复合物而抑制钙调磷酸酶[27]的作用。有研究发现环孢素A可通过抑制钙调磷酸酶的活性从而使Erg3突变体丧失其原本具有的对氟康唑的抗药性。此研究认为，Hsp90-钙调磷酸酶-Erg3基因突变可能是导致酿酒酵母菌产生耐药的途径之一。生物膜是指附着于活组织表面或者无活力组织表面有结构的菌细胞群体，其被自身产生的细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）包裹着，是相对于单个分散的游离状态菌细胞而言的另一种微生物独特的生存形式[28]。生物膜的存在是药敏结果和临床实际情况不符的主要原因之一，许多研究表明，白假丝酵母菌生物膜的形成可能导致大多数唑类抗真菌药的耐[29]药性急剧增加，其导致耐药的机制主要包括：（1）生物膜内的细胞营养受限，生长缓慢，处于代谢休眠期，导致了真菌代谢降低．对抗真菌药物敏感性降低；（2）ECM阻碍药物渗透的物理屏障作用；（3）生物膜耐药相关19 基因的表达；（4）麦角甾醇的异常:白假丝酵母菌的生物被膜成熟期是耐药性提升的时期，而麦角甾醇水平在成熟期减少，故麦角甾醇的减少很可[30]能增加其耐药程度。Mukheoee等研究表明，CDR1和MDR1基因突变株形成的早期生物膜对氟康唑的敏感性比中晚期的生物膜高，而由母株与变异[31]株形成的成熟生物膜对氟康唑均有高度耐药性。Lyons等通过比较生物膜细胞和敏感细胞在基因表达上的差异来研究耐药性，结果证实转运蛋白（CDR或MDR）表达上调可能与生物膜耐药有关。（5）念珠菌生物膜与细菌生物膜类似，其耐药性还可能与微环境的改变（如缺氧、pH值）以及对抗机体的免疫防御等因素有关，生物膜致病菌可采用多种方式对抗机体的免[32]疫防御机制，从而逃脱免疫系统。5-氟胞嘧啶（Fc）是核苷类似物，能选择性进入真菌细胞内，在真菌胞嘧啶脱氨酶作用下转化为氟尿嘧啶，氟尿嘧啶再在尿嘧啶核酸核糖转移酶（Furlp）的作用下最后转变为磷酸核苷氟尿嘧啶（FuMP）。磷酸核苷氟尿嘧啶渗入RNA分子内，破坏真菌RNA的结构和功能，进而发挥抗真菌作[33]用。此外，FuMP还能转化为FdTMP渗入DNA分子，干扰DNA的功能，最近的分子生物学研究确定了Furlp突变在白假丝酵母菌对Fc耐药中的作用[33]。功能缺失或缺陷的Furlp不能有效地把Fc转化成毒性的FuMP，因而出现耐药。大部分白假丝酵母菌Fc耐药的临床株Furlp基因均有C30lT突变，C30lT突变通常发生在Furlp的保守区域，C30lT纯合突变时菌株表现为Fc高度耐药株，C30lT杂合突变表现为中度耐药性．把野生型FURl基因转化[34]至纯合C310T突变子后，发现转化子从对Fc耐药转变为敏感，还有研究提示，胞嘧啶脱氨酶（cyosinedeaminase）、胞嘧啶透酶（cytosinepermease）功能缺陷或者胸苷酸合酶活性改变也可能引起白假丝酵母菌对[33，34]Fc耐药。目前应用于临床的多烯类抗真菌药物主要是两性霉素B（AMB），这类药物能与真菌细胞膜麦角固醇形成复合体，此复合体形成穿膜的孔洞，从而20 导致快速杀灭白假丝酵母菌，是快速杀菌药。AMB耐药机制有：（1）两性霉素B进入细胞内的第一道屏障是药物穿过真菌的细胞壁，这一通路发生改变可能是真菌发生耐药的原因之一；（2）真菌细胞对两性霉素B引起的氧[35]化现象敏感性降低；（3）ERG3基因突变后，真菌细胞内的14α-甲基法尼醇堆积，细胞膜中脂类的数量和质量均发生变化，尤其是麦角固醇含量减少，这些变化降低了细胞膜与两性霉素B结合的机率。此外，唑类抗真菌药则能抑制麦角甾醇的生物合成，从而致使细胞膜中缺失与两性霉素B结合的位点，最后导致真菌对两性霉素B产生耐药。3.4药敏试验对治疗的指导意义近年来许多抗真菌药物广泛应用于临床，假丝酵母菌耐药菌株逐渐增多，耐药率增高。美国Bauters等研究发现氟康唑的耐药率为21％。叶红等对1128株阴道假丝酵母菌药敏检测结果显示，阴道假丝酵母菌对6种药物的敏感性依次为：制霉菌素>两性霉素B>酮康唑>益康唑>咪康唑>氟胞嘧啶。本研究发现，假丝酵母菌对药物的敏感性由弱到强依次为：氟康唑、氟胞嘧啶、伏立康唑、伊曲康唑、两性霉素B，与国内外研究所得结论相似。两性霉素B属多烯类抗生素，其作用机制是通过与假丝酵母菌细胞膜上的甾醇结合，损伤膜的通透性，导致假丝酵母菌细胞内钾离子、核苷酸、氨基酸等外漏，破坏正常代谢而起抑菌作用。虽然耐药菌株很少，但其严重的输液反应、肾脏毒性、贫血、血小板减少等副反应限制了其在临床的广泛应用。氟胞嘧啶为人工合成的抗真假丝酵母菌药，抗菌谱窄，仅对假丝酵母菌、隐球菌及曲菌中的少数菌株有效，对其他假丝酵母菌均无抑制作用。该药为抑菌剂，高浓度时具杀菌作用。其作用机制在于药物通过真假丝酵母菌细胞的渗透酶系统进入细胞内，转化为氟尿嘧啶替代尿嘧啶进入假丝酵母菌的脱氧核糖核酸中，从而阻断核酸的合成。假丝酵母菌对本品易产生耐药性，在较长疗程中即可发现假丝酵母菌耐药现象。氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑均为三唑类抗假丝酵母菌菌药物（伊曲康唑为合成的21 三氮唑衍生物），通过抑制假丝酵母菌中由细胞色素P450介导的14a-甾醇去甲基化，从而抑制麦角甾醇的合成，导致假丝酵母菌膜通透性和膜上许多酶活性改变，抑制假丝酵母菌的生长。近年来，随着假丝酵母菌感染患者的增加，唑类药物的广泛应用，有关假丝酵母菌耐药的报道日益增多。假丝酵母菌对唑类药物的耐药机制相当复杂，其中白假丝酵母菌对唑类耐药的主要作用机制是靶位酶的改变以及多药外输转运子(CDR1，CDR2及MDR1)[36]对药物外排量的增加。本研究中氟康唑的耐药性是较高的，可能是因为其在临床中应用普遍，诱导耐药菌株产生有关。伏立康唑虽较为敏感，耐药率亦不高，但其服用后视觉障碍及皮肤反应较为常见，故不宜长时间服用。伊曲康唑脂溶性高，口服吸收好，半衰期长。本研究发现伊曲康唑对假丝酵母菌的敏感性较高，是治疗VVC时唑类药物中的首选。尽管治疗结果受很多因素的影响，体外试验结果与临床疗效的相关性仍有待进一步评估，但一定程度可作为临床选药参考，对选择敏感药物和[37,38]选择药物剂量提供依据。综上所述，目前白假丝酵母菌仍是RVVC及VVC的主要致病菌，非白假丝酵母菌在RVVC组所占比例较在VVC组高，非白假丝酵母菌中仍以光滑假丝酵母菌最为多见；唑类药物中伊曲康唑敏感性最高，是治疗VVC时唑类药物中的首选；RVVC组假丝酵母菌对氟康唑的敏感性明显低于VVC组，非白假丝酵母菌对氟康唑的敏感性明显低于白假丝酵母菌。22 4结论（1）VVC、RVVC的主要致病菌仍是白假丝酵母菌。（2）RVVC组非白假丝酵母菌比例高于VVC组。（3）RVVC组假丝酵母菌对氟康唑的敏感性明显低于VVC组。（4）非白假丝酵母菌对氟康唑药物敏感率低于白假丝酵母菌。23 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复发性外阴阴道假丝酵母菌病耐药性研究进展综述外阴阴道假丝酵母菌病(vulvovaginalcandidiasis，VVC)曾称为霉菌性阴道炎、外阴阴道念珠菌病等，VVC的主要临床表现有外阴瘙痒、灼痛难忍、阴道分泌物增多，并伴有泌尿系症状及性生活不适等。妇科检查可见外阴阴道水肿、潮红、并见明显抓痕，阴道分泌物呈豆渣样、凝乳状附着于外阴及阴道粘膜，用棉拭子擦除后可见潮红或破损的阴道粘膜。VVC的局部症状强烈且易于复发，患者常常以外阴瘙痒难忍就诊。其病原菌是以白假丝酵母菌为主的酵母菌，其他如光滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌等占少数。1VVC的分类VVC可分为单纯性及复杂性两类。单纯性VVC指正常非孕宿主发生的、由白假丝酵母菌所致的轻或者中度VVC及散发VVC。复杂性VVC则包括:重度VVC、复发性VVC、妊娠期VVC所致的VVC、非白假丝酵母VVC或者宿主为应用免疫抑制剂者、免疫低下者、未控制的糖尿病者。见表1。复发性[1]VVC是指一年内有症状性VVC发作四次或四次以上。重度VVC是指临床症状严重，外阴或阴道皮肤黏膜有破损，按VVC评分标准(见表2)，评分大于或等于7分者为重度VVC。近年来,VVC的发病率有明显上升趋势,成为育龄期妇女发病率较高的一种感染性妇科疾病,75%的女性一生中至少有一次外阴阴道假丝酵母菌病的发病经历,40%-50%的VVC病人有再次发作的经历，［２］5％-10%的病人则发展为RVVC。28 表1VVC的分类单纯性外阴阴道假丝酵母菌病复杂性外阴阴道假丝酵母菌病(以下单种或多种情况时)(以下单种或多种情况时)偶发性VVC复发性VVC(RVVC)轻、中度VVC重度VVC白假丝酵母菌非白假丝酵母菌正常健康宿主特殊宿主如:妊娠期、未控制的糖尿病、免疫抑制等表2VVC评分标准0分1分2分3分瘙痒无偶有发作，可被忽略能引重视持续发作，坐立不安疼痛无轻中重充血、水肿无轻中重抓痕、皲裂、糜烂无————有分泌物量无较正常稍多量多，无溢出量多，有溢出2VVC及RVVC的宿主病因VVC的病因较为复杂,主要与以下因素有关:⑴发病年龄：育龄妊娠妇女患病率则可高达30%～40%而绝经期妇女和儿童不易患VVC,育龄期妇女处于性活跃期，体内有一定的雌激素水平，引导内糖原丰富，易患VVC，尤其是月经前，体内雌激素水平达到高峰期，阴道内上皮细胞富含糖原，在阴道乳杆菌的作用下阴道PH值下降，酸度较高，利于假丝酵母菌的生长。儿29 童和绝经期妇女体内雌激素水平低下，阴道上皮菲薄，糖原缺乏，较少发生VVC。⑵季节因素，夏季及秋季气候湿度大，气温较高，女性外阴湿度大，是假丝酵母菌生长的有利环境，VVC、RVVC的发病也较高。⑶宿主基础状态因素。糖尿病患者体内血糖水平高,导致阴道上皮富含糖原，乳杆菌的作用使阴道内ＰＨ值酸度增加，假丝酵母菌易于生长繁殖而致病；妊娠期易患ＶＶＣ是众所周知的，几乎２０％的孕妇会患一次ＶＶＣ，这同样也是跟孕妇体内雌激素水平的增高密切相关，高雌激素水平不但使阴道内酸度增加同时雌二醇还能诱导白假丝酵母菌ABC转运蛋白的基因调控,从而诱导白[3]假丝酵母菌多种耐药；妊娠期阴道钻膜充血、水肿、通透性增强,也有利于假丝酵母菌生长；并且由于妊娠期用药的特点及给药方式的不便，妊娠期用药往往选择副作用较小但治疗效果欠佳的中成药制剂，而非敏感抗真菌药，且用药时间较短造成治疗不彻底而疾病反复发作。⑷治疗不规范。许多患者在抗真菌治疗的同时使用抗生素，抗生素的应用会杀灭阴道内乳杆菌及其他正常寄生菌群，改变阴道酸碱度及生态平衡，使假丝酵母菌大量繁殖而引起感染；另外使用免疫抑制剂的患者因为免疫抑制机体抵抗力下降易导致各类感染包括真菌感染；VVC治疗不彻底，急性症状消失就立即停药，不按期复诊没纠正不良的生活习惯，一旦阴道内环境改变尤其月经前后容易导致再次感染。⑸口服雌激素含量高的避孕药因增加了雌激素水平而使VVC的发病率增加；而避孕工具现阶段最常用的避孕套和带尾丝宫内节育器可导致假丝酵母菌的感染增加。⑹个人生活习惯如经常使用卫生棉条、使用长期使用卫生护垫、爱穿紧身或化纤内裤、长筒丝袜等，外阴局部通气性差，湿度和温度增高，假丝酵母菌易于繁殖；频繁的阴道冲洗破坏了阴道的微生态环境及酸碱度，也会使得假丝酵母菌得以大量繁殖而到导致VVC的反复发作；体内锌缺乏可能诱发VVC反复发作；心情抑郁,身[4]体免疫力下降,也易导致ＶＶＣ；也有研究发现心理社会因素也是VVC的诱因,紧张或应激状态是易导致白假丝酵母菌所致阴道炎；也有研究发现喜30 [5]爱甜食、有香料的厕纸、常在氯化过的水中游泳、遗传、过敏的体质或者长时间患过敏性鼻炎等也是易患VVC的因素。3.RVVC的病原学研究3.1丝酵母菌的致病机制假假丝酵母菌为双相菌,即孢子相和菌丝相,一般来说孢子相是不引起[6]临床症状的,致病状态为假丝酵母菌的菌丝相。研究发现假丝酵母菌的致病机制有以下几个步骤：3.1.1定植及入侵假丝酵母菌在阴道粘膜的定植和入侵是其致病的基础，而定植的关键就是粘附，粘附的机理可能是通过假丝酵母菌细胞膜表面甘露糖蛋白的介[7]导形成了与阴道上皮细胞的粘附过程。3.1.2菌丝的形成有研究发现菌丝形成是外阴阴道假丝酵母菌病的一个主要的致病因素[8],菌丝是假丝酵母菌粘附于粘膜表面和其侵入组织能力的要素。有学者在电子显微镜下观察在体或离体的标本,发现白假丝酵母菌的菌丝形成后就[9]能穿入深层组织或上皮细胞基质。一些动物实验发现，如果改变某些基因使白假丝酵母菌不能形成菌丝，这种突变株便出现致病力的下降或丧失。有研究证实,白色假丝酵母菌各种毒力因子表达的关键是菌丝的形成,菌丝的形成使致病菌菌株毒力增加,并且感染性增强。而白色假丝酵母菌与非白[10]色假丝酵母菌比较，白色假丝酵母菌对阴道上皮的粘附能力更强,所以在RVVC、VVC的致病菌中白假丝酵母菌比较多见。假丝酵母菌菌体引起症状的原因是其激活了补体旁路途径,从而产生补体趋化因子和过敏毒素,导致阴道粘膜水肿和炎性细胞浸润,炎症部位巨噬细胞释放的溶酶体酶类可导致局部粘膜及皮肤损伤。3.1.3侵袭性酶类的作用:我们发现有一部分假丝酵母菌携带者并没有临床症状，而在有症状的31 那一部分患者中发现一种分泌型天冬氨酸蛋白酶(SAP)明显增高，两者比较有显著性差异，说明假丝酵母菌的致病症状也就是侵袭性与SPA有关。分泌型天冬氨酸蛋白酶是一种蛋白水解酶,其他的蛋白水解酶还有如碱性磷酸酶,磷脂酶等，而SAP类被认为是VVC及RVVC的重要毒力因子,它的家族基因的表达是假丝酵母菌感染的具有特征性的表象,有学者发现白假丝酵母菌能够侵入组织并在宿主体内扩散是由于分泌型天冬氨酸蛋白酶裂解了[11]宿主细胞的各种蛋白,其中作用较为显著是SAP2。[12]细胞外磷脂酶也是假丝酵母菌致病的主要因素。有学者研究了阴道分泌物中的假丝酵母菌在不同温度下分解蛋白和脂肪的情况发现，有症状的外阴阴道假丝酵母菌病的患者所带的菌株具有很强的分解蛋白质和脂肪的能力，而无症状的患者却没有此特性。目前发现的白色假丝酵母菌细胞外磷脂酶有A、B、C、D四种，其致病的主要机制可能在于对宿主细胞的损伤和水解,磷脂酶B主要是在白念珠菌入侵宿主的早期对上皮细胞产生粘附、入侵和损伤；而白念珠菌表型转换和信息传递与磷脂酶C和磷脂酶D与有关。3.2假丝酵母菌的菌种变迁假丝酵母菌是人体的正常菌群之一，它属于假丝酵母菌属半知菌亚门,芽抱菌纲,隐球酵母目,隐球酵母科,可分布于人体的口腔粘膜、肠道粘膜、皮肤表面、外阴及阴道等地方,是条件致病菌，只有在当机体抵抗力下降或[13.14]局部粘膜受损伤时优势繁殖才会引起假丝酵母菌病,它能引起人或动物[15-17]的感染,可自消化道、泌尿道、阴道等处粘膜侵入机体。现已知约有300种,大多数学者认为可致人类疾病的约9种,白色假丝酵母菌(Candidaalbicans)是首要的致病菌,且它的致病力最强,无论VVC还是RVVC,仍是主要的病原菌,非白假丝酵母菌在RVVC中也占相当比例，如光滑假丝酵母菌(Candidaglabrata)、热带假丝酵母菌(Candidatropiealis)、克柔假丝酵母菌(Candidakrusei)、近平滑假丝酵母菌(Candidaparapsilosis)等。32 [18]VVC的病原菌中80%-90%为白色假丝酵母菌。有报道VVC中白假丝酵母菌占85%-90%,其余光滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌分别占5%～10%[19]及5%。近年来发现,假丝酵母菌致病菌种发生了变化，非白假丝酵母菌菌种引起的感染逐渐增加。有学者研究了1988年到1995年的外阴阴道假丝酵母菌病中非白假丝酵母菌所占的比例分别为9.9%及17.2%,这些非白[20]色假丝酵母菌中以光滑假丝酵母菌为主。白假丝酵母菌依旧为复发性外阴阴道假丝酵母菌病的主要病原菌,另一项研究结果发现RVVC患者非白色[21]假丝酵母菌的分离率达到了22.1%,其中9.3%为光滑假丝酵母菌。4.假丝酵母菌的耐药性研究[22]假丝酵母菌菌种自身存在变异导致耐药菌株的产生,国外有学者报道，应用白假丝酵母菌内特异性探针Cl和Ca3及CARE2与经过EcoRI消化的DNA标本进行Southem杂交,结果发现菌株稳定不变但基因型轻微变化和[23,24]无变化两种情况，即所谓的“亚株漂移”。有学者的基因分析研究认为，RVVC是由单一基因型酵母菌导致的,但是在抗真菌药物的选择作用下,其基因型却可发生选择性的变异或者完全被不相关基因代替。目前,多数学者针对连续发作RVVC感染菌株间的相似性，根据DNA指纹图谱技术研究发现假丝酵母菌菌种存在亚株漂移(即同一菌株,但其基因发生细微变)、菌株基因稳定不变、菌种基因发生替代三种情况。其中“亚株漂移”使假丝酵母菌细胞的可塑性发生改变,增加了其对组织的穿透力，增强了其对抗真菌因子抵抗力,并使其逃避机体的免疫系统致病；而耐药菌株的发生源于基因替代。4.1白色假丝酵母菌对唑类药物的耐药机制4.1.1mdr基因与药物外排泵过度表达目前一致认为mdr基因mRNA水平上调可导致白假丝酵母菌对氟康唑的耐药,通常是由mdrl基因翻译的蛋白转运体将多重药物外排泵。膜转运蛋白Mdrp由mdr基因编码,有害物质被转运蛋白依赖跨膜质子梯度往细胞外33 [25]泵出。耐mdr基因存在于许多原核生物中。Wirsching在对一临床分离的Rmdrl基因过度表达的氟康哇耐药株的研究中,用MPA-FIipping方法连续敲除mdrl的两个等位基因。该研究发现氟康唑耐药与mdrl基因的过度表达有关,而酮康哇与mdrl基因的过度表达无关,且Mdrp底物具有一定的特异性。绝大部分高度耐氟康唑的假丝酵母菌均存在mdrl基因的过度表达,在氟康唑耐药菌中，靶酶基因ergll表达上调的比率为60%，基因外排泵基因cdrl表达上调的比率分别为40%；己有研究证实，cdrl基因将多种唑类药[26、27]物泵出细胞外,而mdrl基因只特异将氟康唑外排。有研究报道，氟康唑FC30耐药株mdrl基因表达上调倍数是敏感株的2.3倍,表明菌株的耐药[28]程度与mdrl基因的表达相关。此外，有研究表明,Fc3O耐药株存在外排泵mdrl基因过表达导致耐药的机制。两种菌株的ergll基因mRNA表达量相当,提示耐药菌靶酶基因表达量并没有上调,只是出现耐药相关基因突变。细胞内药物累积量下降是多数假丝酵母菌耐药的主要原因,多种外排泵基因过度表达导致这一变化,因此，外排泵将有望成为的抗真菌治疗的新靶点。4.1.2锌簇转录因子对耐药基因表达的调控锌簇转录因子是白假丝酵母菌中某些耐药基因表达的关键调节因子，包括UPC2、TAC1和MRR1等，它们的点突变可引起相应耐药基因的过度表达而造成菌株对唑类药物的敏感性降低。ERG11是唑类药物的作用靶位酶，锌簇转录因子Upc2p可调节ERG11以及ERGl、ERG3、ERG4等其他有关麦角固醇生物合成基因的表达，还是麦角固醇代谢的关键调节因子。UPC2基[29]因的过度表达导致细胞对酮康唑、氟康唑的耐药，相反，它的缺失可以影响细胞在厌氧环境的生长并导致细胞对酮康唑和氟康唑高度敏感。TAC1是第1个被发现的介导白假丝酵母菌耐药基因调控的转录活化因子，是CDRl（白假丝酵母菌耐药蛋白Cdr1p的编码基因）和CDR2（白假丝酵母菌耐药[30]蛋白Cdr2p的编码基因）基因表达上调的必需因子。TAC1点突变与CDRl、34 [31-33]CDR2的持续性高表达有关，从而导致耐药的发生。TAC1机能亢进的等位基因能引起CDRl、CDR2的持续性高表达，而TAC1野生型的等位基因在[31]诱导剂如氟奋乃静等的存在下也可以引起CDRl、CDR2表达的上调。4.1.3热休克蛋白90（heatshockprotein90，HSP90）HSP90在靶蛋白的折叠、转运、成熟和降解的过程中起调节作用，是所有真核生物所必须的一种分子伴侣，其通过与与底物结合后导致底物接受刺激信号失败进而失活，此外，HSP90也可以在信号介导后协助底物蛋白折叠，帮助复合物的形成和维持复合物的稳定性。研究表明，Hsp90通过快[34]速选择机制介导酿酒酵母菌对氟康唑抗药性产生的。Hsp90能使一系列基因发生突从而导致抗真菌药物耐药性产生，如Erg3突变引起的耐药；Erg3突变体通过改变细胞膜麦角固醇组成，与此同时，避免合成麦角固醇过程中产生的中间毒性产物堆积，即Erg3基因突变后未能生成具有活性的△5，6去饱和酶，从而引起真菌细胞内聚积的固醇中间产物转变为14α-甲基法尼醇（14α-methylfecosterol），其能够部分代替麦角固醇的功能，支持真菌生存，从而使白假丝酵母菌发生耐药而能在含高浓度氟康唑的培养基上生存。而钙调磷酸酶（Calcineurin）是Hsp90底物蛋白，当真菌受刺激[35]时，钙调磷酸酶可调控产生多种反应，其中包括对氟康唑的耐药机制。钙调磷酸酶主要是通过引起Erg3基因突变介导耐药性产生。环孢素A（CsA）是钙调磷酸酶的抑制物，它能与钙调磷酸酶形成复合物而抑制钙调磷酸酶[36]的作用。有研究发现环孢素A可通过抑制钙调磷酸酶的活性从而使Erg3突变体丧失其原本具有的对氟康唑的抗药性。此研究认为，Hsp90-钙调磷酸酶-Erg3基因突变可能是导致酿酒酵母菌产生耐药的途径之一。4.1.4生物膜的形成及小囊状空泡（vesicularvacuoles）生物膜是指附着于活组织表面或者无活力组织表面有结构的菌细胞群体，其被自身产生的细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）包裹的有结构的菌细胞群体，是相对于单个分散的游离状态菌细胞而言的另一种微35 [37]生物独特的生存形式。生物膜的存在是药敏结果和临床实际情况不符的主要原因之一，许多研究表明，白假丝酵母菌生物膜的形成可能导致大多[38]数唑类抗真菌药的耐药性急剧增加，其导致耐药的机制主要包括：（1）生物膜内的细胞营养受限，生长缓慢，处于代谢休眠期，导致了真菌代谢降低．对抗真菌药物敏感性降低；（2）ECM阻碍药物渗透的物理屏障作用；（3）生物膜耐药相关基因的表达；（4）麦角甾醇的异常:白假丝酵母菌的生物被膜成熟期是耐药性提升的时期，而麦角甾醇水平在成熟期减少，故[39]麦角甾醇的减少很可能增加其耐药程度。Mukheoee等研究表明，CDR1和MDR1基因突变株形成的早期生物膜对氟康唑的敏感性比中晚期的生物膜高，而由母株与变异株形成的成熟生物膜对氟康唑均有高度耐药性。Lyons[40]等通过比较生物膜细胞和敏感细胞在基因表达上的差异来研究耐药性，结果证实转运蛋白（CDR或MDR）表达上调可能与生物膜耐药有关。（5）念珠菌生物膜与细菌生物膜类似，其耐药性还可能与微环境的改变（如缺氧、pH值）以及对抗机体的免疫防御等因素有关，生物膜致病菌可采用多种方[41]式对抗机体的免疫防御机制，从而逃脱免疫系统。有学者在对某些耐氟康唑等唑类药物的白假丝酵母菌进行超微结构观察时发现其最显著的变化是有许多的小囊状空泡，直径150～400nm，敏感菌株中没有此结构。通过电镜负染对亚细胞结构观察发现，大多数小囊状空泡P-120（pelletfractionbycontrifugationat120）部分可见，这种小囊状空泡可能与其它细菌中介导耐药性的膜泡（membranevesicles）相似，从而提出了小囊状空泡导致白假丝酵母菌对唑类药物的耐药机制。4.2白假丝酵母菌对5-氟胞嘧啶耐药机制5-氟胞嘧啶（Fc）是核苷类似物，能选择性进入假丝酵母菌细胞内，在假丝酵母菌胞嘧啶脱氨酶作用下转化为氟尿嘧啶，氟尿嘧啶再在尿嘧啶核酸核糖转移酶（Furlp）的作用下最后转变为磷酸核苷氟尿嘧啶（FuMP）。36 磷酸核苷氟尿嘧啶渗入RNA分子内，破坏假丝酵母菌RNA的结构和功能，进而发挥抗假丝酵母菌作用。此外，FuMP还能转化为FdTMP渗入DNA分子，[42]干扰DNA的功能，最近的分子生物学研究确定了Furlp突变在白假丝酵[42]母菌对Fc耐药中的作用。功能缺失或缺陷的Furlp不能有效地把Fc转化成毒性的FuMP，因而出现耐药。大部分白假丝酵母菌Fc耐药的临床株Furlp基因均有C30lT突变，C30lT突变通常发生在Furlp的保守区域，C30lT纯合突变时菌株表现为Fc高度耐药株，C30lT杂合突变表现为中度耐药性．把野生型FURl基因转化至纯合C310T突变子后，发现转化子从对Fc[43]耐药转变为敏感，还有研究提示，胞嘧啶脱氨酶（cyosinedeaminase）、胞嘧啶透酶（cytosinepermease）功能缺陷或者胸苷酸合酶活性改变也可[42，43]能引起白假丝酵母菌对Fc耐药。4.3白假丝酵母菌对多烯类耐药机制目前临床上多烯类抗假丝酵母菌药物主要为两性霉素B（AMB），这类药物能与假丝酵母菌细胞膜麦角固醇形成复合体，此复合体形成穿膜的孔洞，从而导致快速杀灭白假丝酵母菌，是快速杀菌药。AMB耐药机制有：（1）两性霉素B进入细胞内的第一道屏障是药物穿过假丝酵母菌的细胞壁，这一通路发生改变可能是假丝酵母菌发生耐药的原因之一；（2）假丝酵母菌细[35]胞对两性霉素B引起的氧化现象敏感性降低；（3）ERG3基因突变后，真菌细胞内的14α-甲基法尼醇堆积，细胞膜中脂类的数量和质量均发生变化，尤其是麦角固醇含量减少，这些变化降低了细胞膜与两性霉素B结合的机率。此外，唑类抗假丝酵母菌药则能抑制麦角甾醇的生物合成，从而致使细胞膜中缺失与两性霉素B结合的位点，最后导致假丝酵母菌对两性霉素B产生耐药。4.4对棘白菌素类耐药的机制近年来，新上市的米卡芬净（micafungin）、卡泊芬净（caspofungin，CAS）等成为临床上新应用的棘白菌素（echinocandins）类抗真菌药的代37 表药物。此类药物主要是通过抑制假丝酵母菌细胞β葡聚糖合成酶的活性，从而抑制细胞壁（1，3）β-D-葡聚糖合成，最终起到抗真菌作用。在白假丝酵母菌编码β-葡聚糖合成酶的基因为CaFKS1，一些基因定点突变的方法[45]发现，此区域的突变足够引起对棘白菌素敏感性降低；在一些临床分离对棘白菌素耐药的白假丝酵母菌株中也发现，白假丝酵母菌对棘白菌素类药物敏感性降低与其两个CaFKS1等位基因（Phe641toAsp648）之一的[46]保守区发生突变明显相关。Niimi等为了解在白假丝酵母菌对棘白菌素类药物耐药中MDR1、CDR1、CDR2基因过度表达的作用，构建了过度表达MDR1、CDR1、CDR2基因的白假丝酵母菌转化子，然后检测这些转化子对米卡芬净和卡泊芬净的敏感性，研究结果发现，与野生株相比，它们这两种药物的敏感性无明显差别。故认为，MDR1、CDR1、CDR2基因对于白假丝酵母菌对棘白菌素的敏感性降低中没有明显作用。另外，卡泊芬净存在“浓度依赖的矛盾现象”，即在抗白假丝酵母菌时，，白念珠菌对低浓度的卡泊芬净敏感；而提高卡泊芬净浓度后，其敏感性降低。PKC（即蛋白激酶C）细胞壁[47]合成途径变化可能与这一现象的发生有关。综上所述，白假丝酵母菌对药物的耐药性是影响抗真菌药物疗效的重要因素，其耐药性的产生是一个逐步发展的过程，是多基因在多层次水平变异的结果，因此对白假丝酵母菌耐药机制的研究对于寻找新的治疗策略和开发新的抗真菌药具有重要的指导意义。38 参考文献[l]乐杰.妇产科.人民卫生出版社,2003.259-261[2]pan1L,FidelJr.Immunityinvaginalcandidiasis[J].CurrentopinioninInfectionsDisease2005,18:107-111[3]FanSR,LiaoQP,LiuXP,etal.Vaginalallergicresponseinwomenwithvulvovaginalcandidiasis[J].IntJGynaeeolobstet,2008,101(l):27-30[4]MeyerH,GoettlicherS,MendlingW.Stressasacauseofchronicrecurrentvulvovaginalcandidosisandtheeffectivenessoftheconventionalantimycotictherapy[J].Mycoses,2006,49(3):202-9[5]DondersGG,MertensI,BellenG,etal.Self-eliminationofriskfactorsforrecurrentvaginalcandidosis[J].Myeoses,2011,54(1):39-45[6]SobelJD,MullerG,BuckleyHR.Criticalroleofgermtubeformationinthepathogenesisofcandidavaginitis.InfectImmun,1984,44(3):576-580[7]MccourtieJ,DouglasLJ.ExtracellularPolymerofcandidaalbicans:isolation:analysisandroleinadhesion.JGenMicrobiology.1985,131:495-503[8]RodriguesA,MardhPA,Pina-VazC,etal.GermtubeformationchangessurfacehydrophobicityofCandidacells.InfectDisObstetGynecol.1999(7):222-226[9]SobelJD,Myers,KayeD,etal.AdherenceofCandidaalbicanstohumanvaginalandbullalepithelialcells.JInfeetDis.1981,142:76-82[10]Garsia-TamayoI,CastilloG,MartinezAJ.Humangentialcandidiasis.HischemistryScanningandtransmissionelectricmieroscopy.ActaCytol.1982,26:4-14[11]DebernardisF.Aranciasofthesecretoryaspartlyproteinasegene39 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［41］MUKHERJEEPK，CHANDRAJ．Candidabiofilmresistance［J］．DrugResistUpdat，2004，7（4-5）：301-309．［42］AKINSRA．AnupdateonantifungaltargetsandmechanismsofresistanceinCandidaalbicans［J］．MedMycol，2005，43（4）：285-318.［43］HOPEWW，TABERNEROL，DENNINGDW，etal.Molecularmechanismsofprimaryresistancetoflucytosineincandidaalbicans［J］．AntimicrobAgentsChemother，2004，48（11）：4377-4386.［44］ALANJ．Antimicrobiolagents:antibacterialsandantifungals［J］．JAntimicroChemother，2006，58（1）：231.［45］PARKS，KELLYR，NIELSENKAHNJ，etal．SpecificsubstitutionsintheechinocandintargetFks1paccountforreducedsusceptibilityofrarelaboratoryandclinicalCandidasp.isolates［J］．AntimicrobAgentsChemother，2005，49：3264-3273.［46］NIIMIK，MAKIK，IKEDAF，etal．OverexpressionofcandidaalbicansCDR1，CDR2，orMDR1doesnotproducesignificantchangesinechinocandinsusceptibility［J］．AntimicrobAgentsChemother，2006，50（4）：1148-1155．［47］WIEDERHOLDNP，KONTOYIANNISDP，PRINCERA，etal．Attenuationoftheactivityofcaspofunginathighconcentrationsagainstcandidaalbicans:possibleroleofcellwallintegrityandcalcineurinpathways［J］．AntimicrobAgentsChemother，2005，49（12）：5146-5148．43 攻读学位期间发表的学术论文目录1.阳华，叶元，王玉春，等．外阴阴道假丝酵母菌的菌种与耐药性研究.实用妇产科学杂志．2010，26（10）：756-758.（专业核心期刊，第一作者，作者单位为桂林医学院）2.阳华，姚军．子宫内膜异位症患者血清VEGF的检测及临床意义．华夏医学．2010，23（4）：364-367.3.阳华，姚军．复发性外阴阴道假丝酵母菌病耐药性研究进展．华夏医学，2013，26(2):240-242.44 致谢春去秋来，时光茬苒，转眼间，三年的研究生学习生活即将结束我要衷心地感谢我的恩师姚军教授三年来对我孜孜不倦教诲，对我在学习上认真、严格的要求，在论文撰写过程中给予我在科研方法和能力上精心细致的指导，在临床工作中教会我许多实践知识和与患者的沟通能力。姚老师以她正直的人品、善良的性格、精湛的医术、敬业的精神、谨慎的态度时刻感染着我，这将使我受益终生。师恩难忘，在此，我向我的导师姚军教授致以我最崇高的敬意和最衷心的感谢！并衷心感谢妇科、产科、妇产科门诊及检验科的各位老师在临床工作过程中给我的帮助和指导！衷心感谢妇科的全体护士在收集标本过程中给予我的无私的帮助！衷心感谢检验科的老师在试验过程中给予我的支持和帮助！衷心感谢研究生院的领导和老师们在实验过程中给与我们的帮助和指导以及三年来的教育、培养！衷心感谢参加论文评阅及答辩委员会的各位专家！衷心感谢我的家人和我的朋友一直以来对我的支持、帮助、关心和爱护！再次感谢各位老师和评委在百忙之中抽出宝贵的时间来给我指导，祝各位老师身体健康！45