水产动物物种分子鉴定 COI、16S rRNA分子标记法（报批稿）

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1、ICS65.150B51DB21辽宁省地方标准DB21/TXXXXX—XXXX水产动物物种分子鉴定COI、16SrRNA分子标记法TechnicalspecificationforspeciesmolecularidentificationusingCOIand16SrRNAofaquaticanimals报批稿XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施辽宁省市场监督管理局发布DB21/TXXXXX—XXXX前  言本标准依据GB/T1.1—2009给出的规则制定。本标准由大连市质量技术监督局提出。本标准由辽宁省农业农村厅归口。本标准主要起草单位

2、：辽宁省海洋水产科学研究院。本标准主要起草人：高磊、赫崇波、鲍相渤、高祥刚。附录A、B、C为资料性附录。1DB21/TXXXXX—XXXX水产动物物种分子鉴定COI、16SrRNA分子标记法1　范围本方法规定了水产动物物种分子鉴定COI、16SrRNA分子标记法的相关术语和定义，标记方式，试剂、仪器和设备，样品采集、保存和前处理，DNA提取和检测，序列扩增和测序，以及物种鉴定的方法。本方法适用于水产动物物种分子鉴定COI、16SrRNA分子标记法。2　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件

3、。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1　水产动物物种分子鉴定aquaticspeciesmolecularidentification指利用分子生物学手段,对水产动物样本（尤其适用于形态学特征相近、模糊或丢失的样本）的分子标记进行分析，鉴定生物种类的过程。3.2　聚合酶链式反应polymerasechainreaction（PCR）用一对寡核苷酸引物、四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）为原料，在合适的温度、离子条件和耐热DNA聚合酶

4、催化下，在体外人工合成特异DNA片段的过程。3.3　DNA序列测定DNAsequencing测定DNA分子的核苷酸序列。3.4　序列比对alignment为确定两个或多个序列之间的相似性和同源性，将他们按照一定的规律进行排列。3.5　1DB21/TXXXXX—XXXXDNA条形码-COI细胞色素c氧化酶亚基I（cytochromeccoxidasesubunitI）。1.1　16SrRNA16S核糖体核糖核酸（16SribosomalRNA）。2　标记方式水产动物的COI和16SrRNA的DNA序列进化速度较快，同时又相对保守，可作为分子标记条形码用于

5、物种鉴定。通过PCR技术扩增水产动物的COI和16SrRNA基因部分序列，测序后在已知数据库中进行序列比对，确定物种分类信息。本方法同时对COI和16SrRNA两种分子标记条形码进行分析，并在GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）和BOLDSystem（http://www.boldsystems.org）两个数据库中比对，确保鉴定成功率和准确率。3　试剂、仪器和设备3.1　试剂实验仅使用分析纯试剂，水应符合GB/T6682一级水要求。主要包含以下内容：——无水乙醇；——95 %乙醇；——TE缓冲液（

6、pH 7.6）（100 mol/L Tris-Cl，pH 7.6；10mmol/L EDTA，pH8.0）；——Taq酶（5 U/μL）；——超纯水；——10×PCR缓冲液（500mmol/LKCl；100 mmol/L Tris-Cl，pH8.3；15 mmol/LMgCl2）；——引物（10 μmol/L）；——dNTP混合液（每种脱氧核糖核苷三磷酸浓度2.5mmol/L）；——溴化乙锭（10 mg/mL）；——琼脂糖；——电泳标记物（markers）；——平衡酚；——氯仿/异戊醇（24:1）；——10×Tris硼酸（10×TBE）电泳缓冲液；——

7、灭菌蒸馏水；——液氮；——细胞裂解液（20mmol/L）。3.2　仪器和设备实验用仪器和设备主要包含以下内容：——凝胶成像分析系统；——PCR仪；——低温高速离心机（4 ℃，12000转）；1DB21/TXXXXX—XXXX——稳压稳流电泳仪；——单道可调移液器；——电子天平（0.001 g）；——水浴恒温震荡器；——电泳槽；——紫外分光光度计；——遗传分析仪。1　样品采集、保存和前处理1.1　样品采集、保存样本采集和后续实验应在生物安全实验室进行。选择DNA含量高、多糖等含量低的肌肉、肠道、体腔液、鱼鳍等组织进行采样，样品可通过-20℃冷冻、或4℃冰

8、鲜等方式暂时保存。1.2　样品前处理将样品切成5 mm左右直径的小块或薄片，用灭菌蒸馏水洗净，