16s rrna基因测序法鉴定猪多杀性巴氏杆菌探究

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1、16SrRNA基因测序法鉴定猪多杀性巴氏杆菌探究　　摘要：对66株猪多杀性巴氏杆菌的鉴定结果表明，PCR是一种快速、特异、灵敏的病原检测方法。应用能够扩增大多数原核生物16SrRNA基因的通用引物，对猪多杀性巴氏杆菌疫苗株（EO630）和野外分离株的16S基因rRNA进行PCR扩增，以期为分子水平上准确地鉴别猪巴氏杆菌提供依据。关键词：多杀性巴氏杆菌；16SrRNA；PCR中图分类号：S852.61+2文献标识码：A文章编号：1007-273X（2013）05-0005-02多杀性巴氏杆菌是一种广泛存在的感染致病菌，在我国规模化养殖场常有染病和发病。目前，在兽医临床上对该病的确诊仍普

2、遍采用传统的病原分离方法，即通过对细菌进行纯培养分离，然后从形态学、生理生化反应特征以及免疫学特性等方面加以鉴别，以确定细菌的种属和血清型。虽然这种方法能取得可靠的鉴定结果，但存在操作繁琐，耗时长等不足。近年来，唐先春等[1]建立了猪多杀性巴氏杆菌的PCR检测方法，对66株多杀性巴氏杆菌的鉴定结果表明，PCR检测是一种快速、特异、灵敏的病原检测方法。管宇等[2]成功地利用16S9rRNA基因序列分析方法对禽多杀性巴氏杆菌的分离株及我国的代表性疫苗株进行了鉴定研究，结果表明2株分离菌与对照的强弱毒株之间的同源性为100%。该试验应用能够扩增大多数原核生物16SrRNA基因的通用引物，对

3、猪多杀性巴氏杆菌疫苗株（EO630）和野外分离株的16SrRNA基因进行PCR扩增，以期为分子水平上准确地鉴别猪巴氏杆菌提供依据。1材料与方法1.1试剂UNIQ-10柱式临床样品基因组抽提试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。Premix-Taq酶和DNAMarker均为TaKaRa公司产品。1.2仪器电热恒温培养箱、冰箱、无菌操作台、电泳仪及紫外分析仪、PCR仪。1.3培养基血清肉汤：称取营养琼脂粉末33g加入1000mL蒸馏水，加热溶解后分装高压灭菌（121℃，30min）后，冷却到50～60℃，按3%的比例加入新生小牛血清，低温保藏备用。血液琼脂平板：称取营养琼脂粉末33

4、g加入1000mL蒸馏水，加热溶解后分装，高压灭菌（121℃，30min）后，冷却到50～609℃，按5%～6%的比例加入无菌脱脂纤维兔鲜血，然后制成平板低温保藏备用。麦康凯琼脂平板：称取麦康凯琼脂粉末33g加入1000mL蒸馏水，加热至全部溶解，121℃高压灭菌30min后，制成平板，低温保藏备用。1.4菌株来源猪巴氏杆菌标准疫苗株（EO630），为广东省农科院兽医所提供。猪巴氏杆菌野外分离株，为佛山科学技术学院传染病实验室提供。1.5基因组DNA的抽提将血液琼脂培养基上的野外分离株用无菌生理盐水制成的细菌洗液和猪巴氏杆菌疫苗株，用UNIQ-10柱式临床样品基因组抽提试剂盒抽提细菌

5、基因组DNA。操作步骤如下：（1）取200μL制备好的样品，加入400μLDigestionBuffer混匀，再加入3μLProteinaseK混匀，55℃保温5～10min。（2）加入200μL无水乙醇混匀，然后用1mLTip头将样品全部转移到套放于2mL收集管内的UNIQ-10柱中。（3）8000r/min室温离心1min。（4）取下UNIQ-10柱，弃去收集管中的全部废液，将柱放回收集管中，加入500μLWashSolition，10000r/min，室温离心30s。9（5）重复步骤（4）一次。（6）取下UNIQ-10柱，弃去收集管中的全部废液，将柱放回收集管中，10000r/

6、min，室温离心15s，以除去残留WashSolution。（7）将柱放入新的洁净1.5mL离心管中，在柱中央加入50μLElutionBuffer，室温放置2min。（8）10000r/min，室温离心1min。离心管中的液体即为基因组DNA。样品可以4℃或～20℃保存。1.6引物使用能够扩增大多数原核生物16SrRNA基因序列的通用引物，该引物同时能够扩增出猪附红细胞体和猫血巴尔通氏体的16SrRNA基因序列。引物由上海博亚公司合成。引物序列如下：上游引物：5′-ACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTGGCT-3′；下游引物：5′-CGCGGATCCGCTACCTTGTT

7、ACGACTT-3′。1.7PCR扩增PCR反应在PCR仪上进行，反应体系的总体积为50μL，其中Premix-Taq酶25μL，上、下游引物（50pmol/μL）各1μL，模板为5μL，然后加ddH2O至50μL。扩增程序如下：94℃预变性10min；94℃变性3min，50℃退火1min，72℃延伸2min，32个循坏；最后72℃延伸79min。阳性对照为链球菌疫苗株，以蒸馏水为阴性对照。其他反应程序同上。取10μLPCR产物，经溴化乙锭染色的10g/