ISSR分子标记在水产动物中的应用【文献综述】

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1、毕业设计文献综述生物科学ISSR分子标记在水产动物中的应用[摘要]ISSR是一种基于微卫星序列发展起来的新的分子标记，具有简便、稳定、DNA多态性高等优点。ISSR标记呈孟德尔式遗传，大部分ISSR标记为显性标记。在水产生物品种鉴定、亲缘关系分析、遗传多样性检测、遗传图谱构建和分子标记辅助育种等方面有着显著的作用。 [关键词]ISSR;技术;水产生物;应用前言近年来，分子遗传标记的研究与应用得到了迅速的发展。20世纪80年代中期以来，随着PCR技术的出现，基于PCR技术的分子标记，如随机扩增多态性(RAPD)、DNA指纹图谱(小卫星)、简单序列重复(微卫星)、扩增片段长度多态性(AFLP

2、)、单核苷酸多态性标记以及线粒体DNA标记等得到广泛的应用。近年来又发现一种新的标记技术，即简单重复序列扩增—ISSR-PCR。该技术能提供较大数目的DNA片段,可以扫描基因组内的多态位点,因而也是一种用于分析物种、种群、不同品系、甚至是个体间遗传差异的理想方法。ISSR标记方法具有无需知道任何靶标序列的微卫星背景信息、遗传多态性高、检测快速等特点,在遗传多样性研究中具有广泛的应用前景。本文就ISSR技术原理及在水产生物中的应用做简单阐述。1ISSR-PCR1.1ISSR-PCR原理ISSR-PCR技术最早是Zietkiewicz(1994)提出的一种简单重复序列间扩增多态性分子标记技术

3、。它是以PCR技术为基础，利用真核生物基因组中广泛存在的SSR来设计引物，无需预先克隆和测序，从而对位于反向排列、间隔不太大的重复序列间的基因组片段进行PCR扩增，扩增产物进电泳分离获得多态性图谱。ISSR又依引物在5’或3’端加锚定碱基与否而分为锚定简单重复序列间扩增和非锚定简单重复序列间扩增，亦称，MP-PCR。ISSR的引物是由2-4个核苷酸组成的简单串联重复序列和5’或3’6端锚定的1-3个选择性碱基两部分组成，这样保证了引物与基因组DNA中特定SSR的5’或3’端结合，从而进行PCR扩增；MP-PCR则直接以微卫星为引物进行PCR扩增。ISSR标记扩增的DNA片段较短，一般为1

4、00-500bp。1.2ISSR技术实验操作1.2.1DNA提取一般采用常规的提取DNA的方法，水产动物中提取常采用SDS法，一些贝类和海藻采用CTAB法。一般不需要对提取的DNA进行纯化，但需对DNA样品质量和浓度进行测定1.2.2引物设计引物设计师ISSR技术中最关键、最重要的一步。用于ISSR的引物中简单串联重复序列常为：二核苷酸重复序列、三核苷酸重复序列等，还有些为死核苷酸重复序列，重复次数n一般为4-8次，使引物的总长度打到20bp左右。ISSR的扩增结果于引物序列、重复序列的单位核苷酸以及加锚的位置等有密切关系。ISSR技术中所用的引物以于SSR重复序列互补的加锚二核苷酸重复

5、序列为主，寡聚三核苷酸、四核苷酸引物用的较少。虽然ISSR引物为通用引物，但不同种类中能够扩增出带纹的引物存在较大差异，所以引物要进行筛选，从而保证技术的可靠性。1.2.3PCR扩增为保证ISSR-PCR反应结果的清晰、准确，必须堆扩增条件进行优化。音响扩增反应的主要因素有模板浓度、Mg2+浓度、TaqDNA酶，dNTPs浓度、引物浓度及退火温度等。1.2.4电泳及染色6PCR产物需经电泳分离、染色显示后才能进行谱带观察、统计。ISSR电泳琼脂糖浓度常用1.5%-2.5%，聚丙烯酰胺常用浓度为6%。用硝酸银或溴化乙啶(EB)染色后，在可见光(银染)或者紫外光(EB染色)下进行观察，根据同

6、一点带的有无，编成0/1矩阵输入计算机，然后即可根据研究目的，应用相关软件进行分析。一般而言，聚丙烯酰胺和银染的分辨效果比琼脂糖和溴化乙啶要高，用较长(可达到20cm)或浓度更高(2%)的琼脂糖凝胶有助于提高分辨率。2ISSR分子标记的应用2.1ISSR分子在植物上的应用现阶段ISSR分子标记在植物种质资源研究中应用于：1.种质资源鉴定和指纹图谱构建。如Chaters等利用ISSR分子标记技术构建油菜DNA指纹图谱，王新宇等用ISSR分子标记技术对多态性水平较低的小麦种内指纹图谱，黄光文等用4条ISSR引物成功构建18个水稻新材料的。2.遗传多样性和亲缘关系。。ISSR分子标记技术凭借其

7、多态性丰富等特点已经被广泛应用于植物种质资源遗传多样性和亲缘关系研究。如Wofe等用8个引物对玄参科钓钟柳属(PenstemonL.)杂种进行ISSR分析，研究结果清楚地支持物种P.cievelandii是二倍体杂种起源的说法。Joshi等用ISSR技术研究稻属(OryzaL.)的42个品种，包括28个野生品种(9个基因型)、1个栽培种以及3个相关属的品种，发现在种间和种内均表现出很高的多态性，研究结果表明，稻属是多途径进化的。2.