欢迎来到天天文库
浏览记录
ID:34192029
大小:2.32 MB
页数:49页
时间:2019-03-03
《rb94增强人肺腺癌细胞系a549放射敏感性的研究》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、山东大学硕士学位论文Rb94增强人肺腺癌细胞系A549放射敏感性研究姓名:刘芳申请学位级别:硕士专业:肿瘤学指导教师:程玉峰20090512山东大学硕士学位论文Rb94增强人肺腺癌细胞系A549放射敏感性研究中文摘要目的:运用分子生物学技术克隆人视网膜母细胞瘤基因(Rb94),构建重组真核表达质粒pIRES-Rb94,观察Rb94基因对人肺腺癌细胞系A549中鞘氨醇激酶(SphK)表达的影响,初步研究A549细胞中鞘氨醇激酶表达的变化在抑制增殖、促进凋亡方面可能发挥的重要作用;观察Rb94基因对A549细胞的放射增敏作用,初步探讨其作用机制,为以Rb94基因为靶点进行肿瘤放射增敏提供理论
2、依据。方法:根据Rb94基因序列设计、合成引物,从人肺腺癌细胞系A549中提取总RNA,经逆转录得到目的cDNA,用PCR技术扩增Rb基因CDS区域(2451bp),基因两侧均加入XboI酶切位点,酶切产物琼脂糖凝胶电泳,切胶纯化,回收2451bp片断,将回收的片断用T4DNA连接酶连接入pMDl9-T载体,构建克隆载体pMDl9一T—Rb94,并进行DNA序列双向测序分析验证正确后,转化感受态大肠杆菌DH5@,挑选单克隆,提取质粒,再次经酶切鉴定和DNA序列测序验证正确后,使用XhoI酶切位点对重组表达质粒pMDl9-T—Rb94进行酶切,构建以内部核糖体进入位点(IRES)相连的Rb
3、94基因的真核表达质粒pIRES-Rb94,经脂质体2000转染人肺腺癌细胞系A549,然后加入G418筛选,三周后挑选多个单一抗性克隆扩增培养。实时定量RT—PCR和Westernboltting法检测稳定转染细胞株中Rb94基因的表达,Real—timeRT-PCR法和免疫荧光染色法检测Rb94基因对人肺腺癌A549细胞系中SphK表达的影响,细胞计数法绘制生长曲线、计算细胞倍增时间;real-timeRT-PCR检测hTERT、Bcl-2mRNA的表达;成克隆实验检测plRES—Rb94对A549细胞放射敏感性的影响,计算放射增敏比(SER):流式细胞仪(FCM)分析细胞周期,观察
4、转染前后各期细胞数量的变化并且运用流式细胞仪检测凋亡分数。结果:克隆Rb94基因的DNA片段和GeneBank上报道的Rb序列的一部分基本一致,且经酶切鉴定,Rb94基因成功插入真核表达质粒plRES,构建重组表达质粒plRES—Rb94,山东大学硕士学位论文转染人肺腺癌细胞系A549后获得稳定转染细胞系,命名为pIRES—Rb94一A549。与A549细胞相比,pIRES—Rb94-A549细胞中Rb94基因在mRNA和蛋白水平表达增高:鞘氨醇激酶-l(SphK-1)在mRNA和蛋白水平表达下调而鞘氨醇激酶-2(SphK-2)表达上调;pIRES—Rb94一A549细胞的倍增时间延长(
5、31.5h:39.5h;t=5.15,尺0.01);hTERT、Bcl-2mRNA表达下降(0.02:1.00;Z=18.99,尺O.01;0.01:1.00;t=13.73,尺0.01);G。+M期细胞增加(35.91%:4.53%;t=36.78,P=-O.oo),G—G。期和S期细胞减少(47.02%:74.07%;t=11.71,P=-O.00和17.07%:22.32%;t=2.30,尺O.05);根据细胞生存分数拟合存活曲线,由D。值计算的SER为1.30。结论:成功构建真核表达质粒pIRES-Rb94并可有效转染肺腺癌细胞系A549,Rb94基因抑$0SphKl的表达,而增
6、强SphK2的表达。Rb94基因对A549细胞具有明显放射增敏作用,其机制可能是G:+M期阻滞作用;抑$!
7、SphKl的表达,增强SphK2的表达以及下调hTERT、Bcl-2mRNA表达,并可能通过调节细胞周期来影响细胞增殖,为基因治疗增强肿瘤细胞放射增敏性的研究提供一定途径。关键词:基因;视网膜母细胞瘤;A549细胞;放射敏感性2山东大学硕士学位论文ResearchOf一⋯‘enhancementofretinoblastomaResearcradiosensitlsinl乏enllancementOlretinolastomaOI(Rb94)inlungadenocarcinoma
8、cellline(A549)AbstractoBJEC’l’lVE:ToamplifytheRb94genefragmentandanalyzetheDNAsequence,andthentoconstructeukaryoficexpressionplasmidspIRES-Rb94.ToinvestigatetheeffectofRb94ontheexpressionofSphKandthefuctionsofSphKinthe
此文档下载收益归作者所有