rb94增强人肺腺癌细胞系a549放射敏感性研究

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1、山东大学硕士学位论文Rb94增强人肺腺癌细胞系A549放射敏感性研究中文摘要目的：运用分子生物学技术克隆人视网膜母细胞瘤基因(Rb94)，构建重组真核表达质粒pIRES-Rb94，观察Rb94基因对人肺腺癌细胞系A549中鞘氨醇激酶(SphK)表达的影响，初步研究A549细胞中鞘氨醇激酶表达的变化在抑制增殖、促进凋亡方面可能发挥的重要作用；观察Rb94基因对A549细胞的放射增敏作用，初步探讨其作用机制，为以Rb94基因为靶点进行肿瘤放射增敏提供理论依据。方法：根据Rb94基因序列设计、合成引物，从人肺腺癌细胞系A549中提取总RNA，经逆转录得到目的cDNA，用PCR技术扩增Rb基

2、因CDS区域(2451bp)，基因两侧均加入XboI酶切位点，酶切产物琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化，回收2451bp片断，将回收的片断用T4DNA连接酶连接入pMDl9-T载体，构建克隆载体pMDl9一T—Rb94，并进行DNA序列双向测序分析验证正确后，转化感受态大肠杆菌DH5@，挑选单克隆，提取质粒，再次经酶切鉴定和DNA序列测序验证正确后，使用XhoI酶切位点对重组表达质粒pMDl9-T—Rb94进行酶切，构建以内部核糖体进入位点(IRES)相连的Rb94基因的真核表达质粒pIRES-Rb94，经脂质体2000转染人肺腺癌细胞系A549，然后加入G418筛选，三周后挑选多个单一抗性

3、克隆扩增培养。实时定量RT—PCR和Westernboltting法检测稳定转染细胞株中Rb94基因的表达，Real—timeRT-PCR法和免疫荧光染色法检测Rb94基因对人肺腺癌A549细胞系中SphK表达的影响，细胞计数法绘制生长曲线、计算细胞倍增时间；real-timeRT-PCR检测hTERT、Bcl-2mRNA的表达；成克隆实验检测plRES—Rb94对A549细胞放射敏感性的影响，计算放射增敏比(SER)：流式细胞仪(FCM)分析细胞周期，观察转染前后各期细胞数量的变化并且运用流式细胞仪检测凋亡分数。结果：克隆Rb94基因的DNA片段和GeneBank上报道的Rb序列的

4、一部分基本一致，且经酶切鉴定，Rb94基因成功插入真核表达质粒plRES，构建重组表达质粒plRES—Rb94，山东大学硕士学位论文转染人肺腺癌细胞系A549后获得稳定转染细胞系，命名为pIRES—Rb94一A549。与A549细胞相比，pIRES—Rb94-A549细胞中Rb94基因在mRNA和蛋白水平表达增高：鞘氨醇激酶-l(SphK-1)在mRNA和蛋白水平表达下调而鞘氨醇激酶-2(SphK-2)表达上调；pIRES—Rb94一A549细胞的倍增时间延长(31．5h：39．5h；t=5．15，尺0．01)；hTERT、Bcl-2mRNA表达下降(0．02：1．00；Z=18．9

5、9，尺O．01；0．01：1．00；t=13．73，尺0．01)；G。+M期细胞增加(35．91％：4．53％；t=36．78，P=-O．oo)，G—G。期和S期细胞减少(47．02％：74．07％；t=11．71，P=-O．00和17．07％：22．32％；t=2．30，尺O．05)；根据细胞生存分数拟合存活曲线，由D。值计算的SER为1．30。结论：成功构建真核表达质粒pIRES-Rb94并可有效转染肺腺癌细胞系A549，Rb94基因抑$0SphKl的表达，而增强SphK2的表达。Rb94基因对A549细胞具有明显放射增敏作用，其机制可能是G：+M期阻滞作用；抑$!

6、SphKl的

7、表达，增强SphK2的表达以及下调hTERT、Bcl-2mRNA表达，并可能通过调节细胞周期来影响细胞增殖，为基因治疗增强肿瘤细胞放射增敏性的研究提供一定途径。关键词：基因；视网膜母细胞瘤；A549细胞；放射敏感性2山东大学硕士学位论文ResearchOf一⋯‘enhancementofretinoblastomaResearcradiosensitlsinl乏enllancementOlretinolastomaOI(Rb94)inlungadenocarcinomacellline(A549)AbstractoBJEC’l’lVE：ToamplifytheRb94genefrag

8、mentandanalyzetheDNAsequence，andthentoconstructeukaryoficexpressionplasmidspIRES-Rb94．ToinvestigatetheeffectofRb94ontheexpressionofSphKandthefuctionsofSphKintheregulationofcellproliferationandapoptosisincancel"cells．Andtostudyandr