malat1靶基因akap9在大肠癌的表达及其调控机制的初步研究

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1、南方医科大学2010级硕士学位论文MALATl靶基因AKAP9在大肠癌的表达及其调控机制的初步研究TheexpressionofMALAT1targetgeneAKAP9inColorectalCanceranditsRegulationmechanism课题来源：国家自然基金学位申请人谢林英导师姓名李祖国教授专业名称病理学与病理生理学培养类型学术型培养层次硕士所在学院基础医学院2013年5月29日广州硕士学位论文MALATl靶基因AKAP9在大肠癌的表达及其调控机制的初步研究硕士研究生：谢林英导师：李祖国教授摘要结直肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤，其发病率和病死率在消化系

2、统恶性肿瘤中仅次于胃癌、食管癌和原发性肝癌，其发生率在我国有明显增加趋势。近些年来，虽然随着诊疗新技术的应用和化疗药物的不断更新，结直肠癌患者的预后得到了极大地改善，但是患者总的生存率并没有得到显著提高，主要原因是多数结直肠癌患者在行根治性手术前已出现了转移。我们前期研究证实长非编码RNA基因MALATl(metastasisassociatedlungadenocarcinomatranscriptl)即肺转移相关转录本1与结直肠癌转移关系十分密切，并且长非编码RNA基因MALATl可通过调控转移相关靶基因在结直肠癌转移中起重要作用，其中AKAP9(A型激酶锚定蛋白9)

3、基因是受MALATl基因调控的重要靶基因之一。AKAP9是AKAPS家族中的一员。AKAP9蛋白定位于中心体、高尔基体等部位AKAP9基因定位于染色体7q21．q22，全长169．81Kb。AKAP9编码基因中的1．8外显子通过选择性剪接能产生多种异构体，其中包括AKAP450、AKAP350、AKAPl20和Yotiao等，Yotiao是AKAPS家族中的功能最活跃的一员，能激活PKA促进Actin的表达。AKAP9与结直肠癌发病关系的研究尚处于起步阶段，关于AKAP9与结直肠癌转移的研究，国内外还未见文献报道。MALATl调控AKAP9的机制以及AKAP9在肿瘤转移中

4、的作用还不清楚。已有研究表明MALATl可以通过调控细胞内SR蛋白而调控相关基因的可变剪接，因此我们提出MALATl通过调控SR蛋白并激摘要活AKAP9．PKA．EMT信号通路促进结直肠癌侵袭和转移的研究设想。本课题主要内容以下：一、检测AKAP9在结直肠癌细胞株和癌组织标本中的表达，初步探讨AKAP9蛋白的表达与结直肠癌的关系；二、利用逆转录病毒感染系统，过表达、敲低结直肠癌细胞MALATl基因，通过RNA．FISH联合免疫荧光共定位分析技术、RNA．IP技术和Westemblotting技术分析MALATl是否通过与SR蛋白调控AKAP9基因。本论文主要着重研究AKA

5、P9在结直肠癌细胞系和临床组织样本中的检测以及MALATl对结直肠癌细胞SR蛋白的调控作用。第一部分AKAP9在结直肠癌细胞中的表达运用real．timePCR、和Westemblot方法在基因和蛋白水平检测AKAP9在8种结直肠癌细胞株中的表达；同时应用细胞免疫化学S-P法，检测8株结直肠癌细胞中AKAP9蛋白的表达情况。real．timePCR矛IWestemblot检测了8种结直肠癌细胞株中AKAP9的表达，结果表明，real．timePCR和Westernblot检测的结果比较一致。8株细胞中AKAP9均有表达，在高转移的LOVO、SW620中表达较强，在由南方医

6、科大学病理科自建的具有高选择肝脏转移特性的SW480亚系SW480／M5细胞株中表达也较高，在结肠癌原发癌建系的SW480、HCTll6、DLDl细胞株中为中低度表达，综上，AKAP9在转移性较高的结直肠癌细胞中表达明显高于无转移性或低转移性大肠癌细胞。细胞免疫化学检测AKAP9蛋白在结直肠癌细胞中的表达，结果表明：AKAP9蛋白表达的阳性信号定位于细胞浆内，在HCTll6，SW480，DLDl细胞株中，基本上是阴性表达，而在LOVO，HT29，LSl74T,SW620，M5中，AKAP9在这5株细胞中明显表达高于HCTll6，SW480，DLDl。硕士学位论文第二部分A

7、KAP9在结直肠癌组织中的表达及临床意义收集南方医院普外科54例新鲜结直肠癌组织和切缘正常粘膜组织(距癌变边缘lOcm)，手术切除后立即置于液氮中，常规一80。C冰箱冻存。进行realtime．PCR反应结果显示：配对结直肠癌组织中AKAP9基因在癌组织中比正常组织中表达高，差异具有统计学意义(P<0．05)其中AKAP9的表达与患者的年龄，性别，癌的分化程度无关，差异无统计学意义(P=0．751，0．328，0．953)但与患者的转移情况有关，差异有统计学意义(P=O．007)。同时收集南方医院病理科存档113例结直肠癌蜡块