大豆mir398家族基因的表达分析、靶基因鉴定及其对逆境胁迫的调控研究

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1、分类号：Q5单位代码：10193密级：公开学号：2012209硕士学位论文大豆miR398家族基因的表达分析、靶基因鉴定及其对逆境胁迫的调控研究ExpressionanalysisofmiR398andidentificationoftargetgeneandregulationresearchfromsoybeanunderstress作者姓名：周永刚学位类别：理学硕士专业名称：生物化学与分子生物学研究方向：植物分子生物学与基因工程指导教师：李海燕教授所在学院：生命科学学院2015年6月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究

2、所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，

3、学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日摘要MicroRNAs（miRNAs）是普遍存在于真核生物中的具有调控功能的非编码小分子单链RNA，它是由具有茎环结构

4、的前体RNA（Pri-miRNA）经过Dicer-like核酸内切酶加工后，生成的长度约为19-24个核苷酸的成熟miRNA。其通过与靶基因mRNA互补结合程度的差异，来诱导沉默复合体裂解或抑制它的靶基因mRNA翻译和表达。植物miRNAs几乎参与所有的生物代谢途径，如细胞壁的生物合成和植物逆境胁迫应答都起着至关重要的作用。因此，本研究采用实时荧光定量PCR的方法对盐、碱、盐碱、脱落酸和干旱胁迫处理的大豆不同组织的miR398家族基因进行表达量分析；利用在线分析软件（psRNATatget）对其靶基因进行预测，并采用改良的RLM-5'RACE法对软件靶基因进行

5、了验证。同时，选用RT-qPCR的方法对其表达量进行分析，最后对靶基因进行亚细胞定位；在此基础上，分别将前体miR398s（Pre-miR398s）基因构建到植物表达载体上（pBasta-miR398s），对拟南芥进行转化，并对Gma-miR398a、Gma-miR398b和Gma-miR398c基因功能进行了初步鉴定。1．通过实时荧光定量PCR的方法，对不同逆境胁迫处理下的大豆不同组织中miR398家族基因表达水平进行分析。结果显示：前体Gma-miR398c基因表达量在盐碱、干旱、脱落酸和盐胁迫时对比转录水平0h，都呈现1h明显下调、3h显著上调，最后在处

6、理12h处下调。而前体Gma-miR398c基因表达量在碱胁迫处理下1h和3h明显上调、最终在12h处表达量明显下调4.5倍；前体Gma-miR398b基因表达量在盐碱、干旱、脱落酸、碱和盐胁迫中都呈现上调趋势，其中在干旱和盐碱胁迫处理下12h表达量较0h提高4倍。2.利用在线分析软件（psRNATatget）对Gma-miR398s的靶基因进行预测，通过改良的RLM-5'RACE法对其靶基因切割位点进行了分析验证。同时，选用RT-qPCR的方法对其表达量进行分析。进一步对其靶基因进行亚细胞定位，采用酶切法将TC452415基因连接到pCAMBIA-1302载

7、体，利用农杆菌注射的方法瞬时转化烟草叶片，通过Leica激光共聚焦显微镜发现其在细胞膜上有明显荧光，结果表明：靶基因TC452415在细胞膜上特异表达。3．将大豆前体miR398s基因构建到以35S为启动子的pBasta植物表达载体上并分别转化农杆菌。采用Floraldip法分别将大豆前体miR398家族基因对拟南芥进行遗传转化，分别获得转前体Gma-miR398a、Gma-miR398b和Gma-miR398c基因T1代拟南芥转基因株系16株、15株和24株。4.对不同T2代各个株系进行分离比筛选，最终选择遵循孟德尔遗传规律的分离比为3：1的单拷贝转基因株系

8、。采用实时荧光定量的方法，对单拷贝T2