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1、分类号：Q815密级：公开UDC：579编号：201421508006河北工业大学硕士学位论文海洋来源放线菌MY0504产纤溶酶的发酵条件优化及提取纯化研究论文作者：侯正欣学生类别：全日制学科门类：工学硕士学科专业：生物化工指导教师：史延茂职称：研究员董超高级工程师DissertationSubmittedtoHebeiUniversityofTechnologyforTheMasterDegreeofBiochemicalEngineeringOPTIMIZATIONOFFERMENTATIONCONDITIONSAND
2、PURIFICATIONFORFIBRINOLYTICENZYMEFROMMARINEACTINOMYCETEMY0504byHouZhengxinSupervisor:ResearcherShiYanmaoSeniorEngineerDongChaoMay2017摘要血栓是血流在血管内面剥落处或修补处的表面所形成的小块，主要是由不溶性的纤维蛋白组成，纤溶酶可以溶解纤维蛋白，从而使血管通畅，防止血栓类疾病的发生。目前应用于临床的溶栓药物成本较高，且副作用大，因此寻求安全有效的溶栓剂是近些年研究的热点。本文测定了产纤溶酶的海
3、洋放线菌菌株MY0504的生长曲线及产酶曲线，确定发酵时间为4.5天。通过单因素试验确定了最适碳源、氮源、装液量、接种量及各无机盐浓度水平。在单因素试验基础上，通过Plackett-Burman设计从影响发酵液酶活的8个因素中选出了葡萄糖、酵母粉、温度3个显著性因素，用最陡爬坡试验将3个因素的取值趋近中心点，然后通过Box-Behnken响应面设计得到3个因素的最优值。在优化后的发酵条件下，发酵液酶活达到2190.6U/mL，是优化前的4倍。尝试了盐析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析等多种分离纯化方法，确定了纤溶酶的
4、纯化流程为：发酵原液离心除菌体、711树脂吸附色素、盐析、PhenylμSphere疏水层析、SephadexG-75凝胶层析。最后纤溶酶比活力达到11000.0U/mg，纯化倍数为101.3倍，回收率为26.1%。对此纤溶酶的部分性质进行了初步探索，发现其分子量约为32kDa，等电点约为8.5。发酵液中的纤溶物质单纯为纤溶酶，不含纤溶酶原，也不含有纤溶酶原激活物，此纤溶酶可在短时间内有效降解纤维蛋白原的α链、β链及γ链，溶栓性较强，溶栓效率高。关键词：海洋放线菌纤溶酶发酵优化分离纯化纤溶特性IIIABSTRACTThro
5、mbosisismainlycausedbytheaccumulationoffibrinintheblood,plasmincandissolvefibrin,sothatitcanmakethebloodvesselsunblocked,andpreventpeoplefromthromboticdiseases.Atpresent,thecostofthrombolyticdrugsishighandthesideeffectsareseriously.Therefore,itisahotspottostudysaf
6、eandeffectivethrombolyticagents.Inthispaper,thegrowthcurveandenzymeproductioncurveofthemarineactinomycetestrainMY0504weredetermined,thefermentationtimewasconfirmedtobe4.5d.Theoptimumcarbonsource,nitrogensource,liquidvolume,inoculationamountandinorganicsaltconcentr
7、ationweredeterminedbysinglefactortest.Basedonthesinglefactorexperiment,threesignificantfactors,namely,glucose,yeastpowderandtemperature,wereselectedfromtheeightfactorsinfluencingtheenzymeactivitybyPlackett-Burmandesign.Thevalueofthefactorsapproachedthecenterpointb
8、ythesteepestclimbingtest,andthentheoptimalvalueofthethreefactorswasobtainedbytheBox-Behnkenresponsesurfacedesign.Undertheoptimizedfermentationconditions
