枯草芽孢杆菌BSD-2全基因组数据挖掘及抗菌物质的分离

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1、分类号：Q93密级：UDC：579编号：河北工业大学硕士学位论文枯草芽孢杆菌BSD-2全基因组数据挖掘及抗菌物质的分离论文作者：胡彦婷学生类别：全日制专业学位类别：工程硕士领域名称：生物工程指导教师：张丽萍职称：研究员资助基金项目：河北省科技计划项目(No.16292904D)；河北省重点基础研究项目(No.13966503D)DissertationSubmittedtoHebeiUniversityofTechnologyforTheMasterDegreeofBiologicalEngineeringGENOMEMININ

2、GANDISOLATIONOFANTIBACTERIALSUBSTANCEFROMBACILLUSSUBTILISBSD-2byHuYantingSupervisor:Prof.ZhangLipingMay2017ThisworksupportedbytheScienceandTechnologyProjectinHebeiProvience.No.16292904D.AndtheKeyBasicResearchProjectinHebeiProvience.No.13966503D.摘要枯草芽孢杆菌是一种重要的植物抗病促生微生

3、物，它的抗病机制主要是通过分泌各种抗菌物质完成，羊毛硫细菌素是其中重要的一种抗菌肽。本实验室前期筛选到一株枯草芽孢杆菌BSD-2，其能够产生抑制灰葡萄孢菌、棉枯萎镰刀菌等病原菌的抗菌物质。本文以BSD-2为研究对象，挖掘了BSD-2中潜在的新型抗菌肽合成基因，分析了挖掘到的潜在新型抗菌肽合成酶的结构和功能，对该合成酶的基因功能进行了验证，并对BSD-2产生的抗菌活性物质进行了分离纯化等方面的研究。1.以BSD-2全基因组为研究对象，利用antiSMASH、BAGEL3和本地Blast等软件挖掘到BSD-2中存在Subtilosi

4、nA、Surfactin、Bacilysin和TasA合成基因簇及其完整的合成通路；另挖掘到BSD-2中存在Fengycin、Bacillaene和Bacillibactin合成基因簇，但其合成通路不完整；预测到BSD-2中存在六个潜在的新型第四类羊毛硫细菌素(ClassIVLanthipeptide)的前体肽合成基因，且其合成基因簇及合成通路较完整。2.利用ProtParam、KinasePhos、VMD等软件对BSD-2中的潜在的第四类羊毛硫细菌素合成酶进行了结构预测及分析。该合成酶与所研究的其它七种对照的潜在第四类羊毛硫细

5、菌素合成酶的理化性质相似，均为亲水性蛋白，大部分为稳定的酸性蛋白；其二级结构中α螺旋和无规卷曲所占比例较大；存在丝氨酸和苏氨酸磷酸激酶结合位点。LANC-like结构域在其进化过程与对应菌株的进化关系保持了高度一致性，而STYKc或S_TKc结构域的保守性较差。由三级结构预测和基因组数据挖掘可以推测出BSD-2中存在第四类羊毛硫细菌素合成酶基因。3.利用PCR技术，扩增出了BSD-2中两个第四类羊毛硫细菌素合成酶候选基因(ClassIVLanthipeptidesynthetaselikegene，T4LSL)，分别为LanLA

6、和LanLB。成功构建了LanLA和LanLB基因的克隆载体，并通过将卡纳抗性基因分别插入到LanLA和LanLB基因中，构建了pB-LanLA-Kana和pB-LanLB-Kana敲除载体。4.BSD-2产生的次级代谢产物依次经过硫酸铵沉淀、弱阴离子交换层析和高相液相色谱分离方法得到抑制灰葡萄孢菌的抗菌物质精提物，且经SDS-PAGE电泳后，只出现了一条约3.0kDa的蛋白条带，经生物自显影原位复性后，该条带具有抑制灰葡萄孢菌的活性。表明BSD-2代谢产物中存在分子量大小约为3.0kDa的抗菌肽。关键字：基因组数据挖掘第四类羊

7、毛硫细菌素抗菌肽基因敲除分离纯化IABSTRACTBacillussubtilisisanimportantmicroorganismofresistingtodiseaseandpromotinggrowth.Anditsresistancemechanismismainlythroughthesecretionofvariousantimicrobialsubstancestocomplete,lantibioticisoneoftheimportantantipeptides.B.subtilisBSD-2,withpla

8、ntpathogenicfungiofBotrytiscinereaandfusariumwiltantimicrobialactivity,wasisolatedandscreenedinprecedentexperiments.Tominethepotent