枯草芽孢杆菌的分离纯化教学教材.ppt

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1、枯草芽孢杆菌的分离纯化目录菌种简介分离步骤生理生化鉴定发酵条件的优化脂肽类抗生素的提取——酸沉淀法脂肽类抗生素的HPLC定量检测讨论菌种简介无荚膜，周生鞭毛，革兰氏阳性菌，有芽孢，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中。枯草芽孢杆菌在自然生长和发酵培养产生的脂肽类抗生素具有很强的抗真菌、病毒、肿瘤、支原体活性，在防治植物病害上具有广阔的应用前景。分离原理芽孢杆菌能产生芽孢，在沸水中加热不会失去生理活性，但是不能产生芽孢的细菌会失去活性，因而得到芽孢菌属，经过进一步的分离及生理生化鉴定得

2、到枯草芽孢杆菌。分离步骤（1）土样的采集：取土壤表层5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入纸袋带回实验室分离。（2）平板的制备：溶化三角瓶中的牛肉汤蛋白胨培养基，以每皿20ml左右倒6个平板。（3）稀释分离法：称取土壤5g放入含有45ml水的三角瓶中，摇动片刻，然后将此瓶用小火加热至悬浊液沸腾，维持15min。而后静止5min，吸取上层液0.1ml加入到含有4.5ml无菌水的试管中，制成1:100浓度的悬液，然后吸取土壤悬浊液0.2ml滴加到牛肉膏蛋白胨培养基平板上，用涂布棒均匀涂布，并将培养基倒置于37℃恒温培养1-2天。（4）挑菌及纯化：从上述分离的平

3、板上分别挑取单菌落中部分菌体，在牛肉膏蛋白胨培养基上划线纯化。（菌体应呈杆状，具芽孢，宽度一致；菌落颜色、形状、质地、透明度等均一致）生理生化鉴定一过氧化氢酶测定将测试菌种接种于肉汤琼脂斜面上，培养1—2天。取一载玻片，在上面加一滴3—10%的过氧化氢，挑取一环菌苔，在过氧化氢溶液中涂抹，若有气泡（氧气）出现为阳性，无气泡者为阴性。二需氧性试验原理：不同种类的芽孢杆菌对氧气的需求性常有差异，因此本实验可作为鉴定芽孢杆菌的一个较重要指标。操作步骤：菌液穿刺接种到上述培养基中，一般于培养3—7天观察结果。若芽孢杆菌在琼脂柱表面生长为好氧菌，沿着穿刺线上生长者为厌氧菌或兼性

4、厌氧菌三、乙酰甲基甲醇实验原理：有些芽孢杆菌发酵葡萄糖产酸，并将产生的酸进一步转化为中性化合物，如乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性环境中可被氧气成二乙酰，后者与蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用，生成红色化合物，即表示试验阳性。若在培养基中加入少量肌酸以补充胍基，可加速反应。培养基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，NaCl5g，蒸馏水1000ml。调节PH6.5，每管分装4—5ml，0.06MPa（8lbf/in2）30min灭菌步骤：将芽孢杆菌测试菌接种于上述培养液中，一般于30摄氏度培养4天，取培养液（约2ml）和等量的40%NAOH相混合，加少量肌酸（约0.5—1mg），充

5、分振荡，2—5min后如培养液呈红色，即为试验阳性。四淀粉水解原理：许多芽孢杆菌产生淀粉酶，能将培养基中的淀粉水解，淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。培养基：在肉汤琼脂中添加0.2%的可溶性淀粉，分装于三角瓶。0.1MPa(15lbf/in2)20min灭菌备用。步骤：将培养基做成平板，凝固后取菌种点种于平板上（每皿点种2点），一般于30摄氏度培养2—4天，形成菌落后，在平板上滴加碘液，以铺满菌落为度，平板呈蓝色，而菌落周围如有无色透明圈出现，说明淀粉被水解，透明圈的大小，可表明水解能力的大小。经生理生化鉴定，确定是芽孢杆菌属纯种后，从中选择一株转接于牛肉膏蛋白胨斜面上，置

6、37℃培养1-2天后备用发酵条件的优化将纯化的菌种转接至LB平板上,37℃培养24h,用接种环取活化菌种,接种于100mlLB液体培养基,30℃、200r/min培养24h作为种子菌。发酵过程中采用单因素试验方法,考察不同培养温度(26、28、30、32、34、36℃)、培养时间(26、32、38、44、50、80h)、接种量(1%、2%、3%、5%、10%)、初始pH值(5、6、7、8、9)、培养基(Landy培养基、Landy修饰培养基Ⅰ、Landy修饰培养基Ⅱ、LB培养基、无机盐培养基)对脂肽类抗生素产量的影响。结果表明,最佳培养条件为Landy培养基,初始pH

7、7·0,接种量3%,发酵培养温度30℃,发酵时间38h。脂肽类抗生素的提取——酸沉淀法培养结束后,7000r/min离心10min,取上清，加HCl调节pH为5·0、4·5、4·0、3·5、3·0、2·5、2·0,7000r/min离心10min,收集沉淀。将沉淀在60℃的烘箱中干燥18h,称重即为脂肽类抗生素粗提物的干重。比较不同pH条件下沉淀的干重,以确定完全沉淀脂肽类抗生素所需的最佳pH值。脂肽类抗生素的HPLC定量检测将脂肽类抗生素粗提物过SephadexLH-20层析柱，每管收集液分别经真空干燥后,加入0·2ml乙醇溶解。对每管乙醇溶液进行