斜带石斑鱼生长抑素前体基因克隆、表达和基因重组

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1、中山大学博士学位论文斜带石斑鱼生长抑素前体基因的克隆、表达和基因重组姓名：叶星申请学位级别：博士专业：生理学指导教师：林浩然20051030叶星中山大学博士论文摘要2005年斜带石斑鱼生长抑素前体基因的克隆、表达和基因重组专业研究方向博士生导师生理学鱼类生理学与分子生物学叶星林浩然院士摘要鱼类的生长主要由生长激素．胰岛素样生长因子I轴(GH一1GF-Iaxis)调节。GH-IGF-I轴的作用开始于垂体中GH的产生，而GH的产生受多种下丘脑激素的控制，包括生长抑素(SS)。生长抑素已被确认为一种广泛分布于神经系统

2、和外周组织的多功能肽，参与中枢神经系统的生理过程，调节着机体的生长、发育和代谢等多种生理过程。本研究结合RT-PCR和5’，3’一race方法从斜带石斑鱼(Epinephetuscoioides)的下丘脑中分离到3种生长抑素前体基因cDNA全序列，这是继金鱼之后第二例在同一种脊椎动物中克隆到3种不同类型生长抑素前体基因的报道。其中斜带石斑鱼I型生长抑素前体(PSSI)cDNA编码123个氨基酸，其C端具有酶切识别位点可剪切产生与所有报道过的物种的I型生长抑素氨基酸序列完全相同的14肽(ssl4)；斜带石斑鱼II

3、型生长抑素前体(PSS【I)cDNA共编码127个氨基酸，带有酶切识别位点可剪切产生28肽的生长抑素SS28，在其c端带有SSj4变异体，此ssl4变异体的氨基酸序列与己报道的鱼类ssl{变异体的相同，与哺乳类的ss28c端的ssl4有2个残基的不同(由Tyr7和Glylo分别代替了phe7和11lrlo)；斜带石斑鱼Ⅱl型生长抑素前体(PSSIlI)cDNA编码110个氨基酸，带有酶切识别位点可剪切产生[Pr02]ss。4。斜带石斑鱼PSSI和II型基因与美洲艘鲸(Lophiusamercanus)的PSSI

4、和PSSII的同源性最高。斜带石斑鱼PSSIII基因则与金鱼(Carazsiusauratus)PSS[tI有较高的同源性。采用RT-PCR法结合Southernblot方法对斜带石斑鱼成鱼的脑部、垂体及外周组织、胚胎期和个体发育不同阶段3种PSS的mRNA进行半定量分析，结果表明3种PSS在垂体及下丘脑等脑部各区斜带石斑鱼(Epinephel砒coioides)生长静素前体基霭的克隆蔓达私鳘里!垩塑均有不同水平的分布。在外周组织中，PSSII比PSSI和PSS[I[有更广泛的组织分布。胃、肠道和卵巢组织PSS

5、的表达量较高。3种PSS的mRNA在未受精卵、受精卵及胚胎发育各期均有分布，孵化出膜前表达量最高，雨出膜后迅速下降；仔鱼个体发育过程中3种PSS基因也均有较大量的表达。mRNA的分布显示斜带石斑鱼的3种PSS基因产物在成鱼以及胚胎的组织分化、仔鱼的发育过程起着重要的生理作用。为了进一步开展对生长抑素功能及应用的研究，本研究利用本校生命科学学院许安龙教授实验室构建的原核表达载体pTRX，进行Ssl4融合表达。携带pTRX．SSl4表达载体的BL21菌株经诱导后获得分子量大小约为15000Da的TRX．SSl4融合

6、蛋白，且有较高的表达量(21～39．9％)。在22～37℃范围内表达的融合蛋白均具有较高的可溶性(≥34％)。利用6His．tag经金属Ni2+离子亲合层析柱纯化获得高纯度融合蛋白(95．6％)。放射免疫检溺显示全菌和上清中SS，4抗原浓度较高(分别含66．27pg／,uI和79．49pg／,u1)，并说明sSl4抗原决定簇呈现在融合蛋白TRX—SSl4的表面。采用pTRX和pGEX二种不同的融合表达载体系统进行多拷贝SSl4融合表达载体的构建与诱导表达，其中采用pGEX所构建的3拷贝SSl4能顺利表达，而pT

7、RX多拷贝的表达水平低或不表达。用RNA结构软件计算所构建的融合基因RNA二级结构的自由能，显示在融合基因表达载体构建过程中，插入的外源基因尽管不改变5’和3’端的主要结构域，仍会对RNA二级结构及表达水平产生影响。利用所制备的重组融合蛋白TRX-SSl4作为抗原与弗氏完全佐剂乳化后免疫新西兰兔。制各了重组生长揶素抗体。酶联免疫(EUSA法)检测显示获得的抗体效价较高，说明重组融合蛋白TRX—SSl4具有较强的免疫原性。同时进行了主动免疫试验，用重组融合蛋白TRX．SSl一作为抗原免疫尼罗罗非鱼(Oreochr

8、omisniloticus)a在雌鱼试验组中，注射TRX—SSl4的试验组比注射TRX的阳性对照组和生理盐水的阴性对照组的生长速度快些，但组间没有显著差异(P>0．05)。雄鱼试验组3个组间试验鱼的生长速度均没有明显的差异(P>O．05)。关键词：斜带石斑鱼，生长抑素，mRNA，融合表达，多拷贝基因，抗体，主动免疫，生长速度lI!呈主些查堂堂主笙苎堡墅!!!!兰一一一——Molecul