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《斜带石斑鱼生长抑制激素受体的克隆、表达和功能研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、斜带石斑鱼生长抑制激素受体的克隆、表达和功能研究中山大学博士学位论文斜带石斑鱼生长抑制激素受体的克隆、表达和功能研究姓名:董海燕申请学位级别:博士专业:海洋生物学指导教师:林浩然20100604中山大学博士论文董海燕年月论文题目:斜带石斑鱼生长抑制激素受体的克隆、表达与功能研究业:专海洋生物学董海燕博士生:导师:林浩然协助指导老师:李文笙摘要生长抑制激素,简称,中文翻译也简称生长抑素和其受体,简称是个多基因家族。生长抑素受体是七次跨膜受体,在脊椎动物的生长,发育和代谢中有着重要作用。本研究首从斜带石斑鱼中分别克隆了,,和的全
2、长序列。运用和检测了斜带石斑鱼的表达情况后选取一些有代表的组织、胚胎、仔鱼不同发育阶段,再采用技术比较分析了斜带石斑鱼///在成鱼各组织,胚胎、仔鱼不同发育阶段的表达分布。在体内外研究了对斜带石斑鱼垂体,生长激素释放以及,/的影响。随后利用斜带石斑鱼垂体细胞原,生长激素受体和代培养系统,研究了.的调节机制和信号通路。在细胞中,利用荧光素酶报告基因分析了介导的转录活性,最后利用荧光标记研究了受体的膜定位。主要研究结果如下:.本研究克隆的斜带石斑鱼,,和的全长序列长度分别分,和,分别编码,,和。斜带石斑鱼的,,和与其它脊椎动物结
3、构类似。四个受体结构上都包括端区域,七个跨膜区域,三个包外环,四个包内环和端区域。在端区域有糖基化位点,段区域和包内环区域有多个磷酸化位点。七个跨膜内每个跨膜区上分别含有。,.,?.?,??,..。.和..。保守序列。四个受体的第一和第二个包外环的相似位置上分别有一个保守的半胱氨酸。此外,在的氮中山大学博士论文董海燕年月端发现了一段由个连续的丝氨酸“”组成的序列。与其它脊椎动物氨基酸序列同源性分析和进化树分析发现,斜带石斑鱼四个生长抑素受体有两个大的进化支:一支是,另一支是//。在进化过程中较为保守,而,和进化中分歧较大。斜
4、带石斑鱼,,和和已知的其他脊椎动物的相应受体分别展现了...%,..%,..%和..%的氨基酸序列一致性。但斜带石斑鱼四种受体间仅有...%的序列一致性。同源性分析表明斜带石斑鱼在同一类型的受体间的同源性要比不同受体类型间的同源性高。此外,在://..数据库中,利用工具,我们发现在斑马鱼,棘鱼,河豚和蛙的基因组序列中都含与哺乳类类似序列。当在进化树中加入这些通过基因组推测来的编码蛋白后,鱼类和哺乳类一样都包括/和//两个大的进化支,而已经报道的虹鳟的和及斑马鱼的都与已知的哺乳类和鸟类的归为一类。.通过结合对的表达研究表明,斜
5、带石斑鱼在中枢神经系统,垂体,卵巢,胃,肠,胸腺,视网膜和肝脏都有表达。在胚胎和幼鱼发育阶段斜带石斑鱼,在未受精的卵中有表达,但受精后母体携带的表达消失,原肠期开始表达,出膜时达到较高水平,此后的所有仔鱼期都有表达。利用定量的方法比较分析了斜带石斑鱼四种在中枢神经系统的前脑,中脑,后脑,脊髓和垂体以及外周组织肝脏,胃,肠,胸腺,视网膜,卵巢共个组织的表达特性。除了在胃肠没有检测到Ⅱ匕和在视网膜没检测到外,其他组织均有四种受体的表达。总的来说,在中枢神经系统表达量要高于外周组织。端脑中的表达量最高,其他组织表达量相对较低。在垂
6、体中表达量最高,其次是肝脏和端脑,然后是中枢神经系统的其他组织和外周组织。也是在垂体中表达量最高,在前脑,肝脏,胃中的量也很丰富。水平除垂体外其他组织均很低。在斜带石斑鱼个胚胎发育时期和个仔鱼时期四种的表达变化很大。和在所有选择的时期都有表达,在囊胚和原肠胚期没有检测到匕的表达,在囊胚期没有检测到的表达。在胚胎阶段,和水平在孵化阶段达到高峰,持续下降直到仔鱼孵出后第五天,表达量再次出现增加是在仔鱼孵出后第十五天,到了第天到达第二个峰值,而却保持一个较低水平。中山大学博士论文董海燕年月和的峰值出现在胚胎发育的脑泡形成期。在仔鱼
7、孵化期和胚体形成期和表达量也较高。孵化后和水平都快速下降,随后从仔鱼孵出后第天到第天,水平逐渐升高而删州则保持一个很低的水平。.在体外,和均能在高浓度时抑制斜带石斑鱼垂体细胞释放,但在低浓度时促进释放。处理.后,,水平比对照组显著升高,并依赖浓度,但对,,和却没有影响。处理.后,,和水平比对照组显著升高,并依赖浓度,但对,和却没有影响。表达则随着和浓度的增高而而显著地降低,同样依赖于浓度。以及肝脏的在体内,斜带石斑鱼腹腔注射后,垂体,,和和的水平比对照组显著升高,而肝脏和的水平比对照组显著降低,并都依赖浓度。但垂体的,及肝脏
8、的,的水平与对照组比较并没有显著差异。在斜带石斑鱼原代培养的垂体细胞中,我们利用处理前后和/磷酸化水平的变化证实能够激活和通路,然后利用通路的抑制剂和通路的抑制剂处理细胞,分析和对抑制的及刺激的表达的抑制作用,分析垂体介导的下游信号。.在瞬时转染了斜带石斑鱼的,,,表达载体的细胞中,与对照
