斜带石斑鱼两种hepcidin基因的分子克隆和生物特性研究

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1、毒(SGIV)、革兰氏阴性菌创伤弧菌、革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和真菌酿酒酵母后，EC．hcpcidinl和EC．hepcidin2的转录水平均出现明显的上调，而且EC-hepcidinl的转录上调相对于EC．hepcidin2更明显。此外，石斑鱼在注射FeCl2后，肝中的EC．hepcidinl和EC．hepcidin2转录水平也发生明显的上调，EC．hepcidinl的转录上调相对于EC．hepcidin2也更明显。EC．hepcidinl和EC．hepcidin2对于铁离子代谢的调节作用可能有利于发挥其抑菌作用。我们通过人工合成EC．hepcidinl和EC-

2、hepcidin2多肽来检测它们的活性。人工合成的EC．hepcidinl和EC．hepcidin2均能显明抑制创伤弧菌和酿酒酵母的生长，并且随多肽浓度的提高其抑菌作用变强，而对金黄色葡萄球菌的抑菌作用不明显。此外，我们发现EC-hepcidinl的抑菌活性要明显强于EC．hepcidin2。本论文中发现含有4个半胱氨酸的hepcidin(EC．hepcidinl和EC．hepcidin2)具有抑菌活性，这种结构的hepcidin鲜有报道，虽然很多8或6个半胱氨酸的hepcidin已报道具有活性。我们构建了hepcidin与绿色荧光蛋白(GFP)的融合表达载体，以此

3、来研究hepcidin在石斑鱼细胞中的定位。将hepcidin-GFP表达载体转染进石斑鱼脾细胞(GS)后，EC．hepcidinl和EC．hepcidin2均在细胞中均匀分布，但是在细胞感染病毒SGIV的早期，EC．hepcidinl向细胞膜聚集并形成环状结构。将病毒SGIV分别和EC-hepcidinl和EC．hepcidin2合成多肽孵育后再感染体外培养的GS细胞，发现和EC．hepcidinl作用后，病毒对细胞的感染进程明显变缓，提示EC-hepcidinl可能在阻止病毒入侵方面起重要作用。关键字：斜带石斑鱼；抗茵肽hepcidin；基因克隆；抗菌活性；新加

4、坡石斑鱼虹彩病毒Illiverandlessabundantinstomach，butEC-hepcidin2transcriptswereonlydetectedinliver．Real-timePCRanalysisshowedthetranscriptionofEC··hepcidinlandEC—hepcidin2wasup—regulatedbyironoverloadandmicrobialchallenges(Singaporegrouperiridovirus，SGIV，Vibriovuln泸cus，Saccharomycescerevisiae,a

5、ndSaccharomycesaureus)inofE．coioides，butEC·hepcidinlwasmoreresponsivethanEC·hepcidin2．nesimilarexpressionpatternbetweenmicrobialchallengeandironoverloadsuggeststheGross·talkbetweenironregulationandhostdefenseagainstmicrobialinvasion．SyntheticEC-hepcidinlandEC—hepcidin2peptidesbothclear

6、lyinhibitedthegrowthoffungiofSaccharomycescerevisiaeandespeciallyGram·negativebacteriumofVibriovulnificus，andEC—hepcidinldisplayedstrongerantimicrobialactivitythanEC—hepcidin2．However,neitherEC-hepcidinlnorEC-hepcidin2displayedantibacterialactivityagainstGram—positivebacteriumofStaphyl

7、ococcusaureus．Inourstudies，itisforthefirsttimetofindsynthetic4-Cyshepcidins(EC-hepcidinlandEC-hepcidin2)displayantimicrobialactivity,althoughmany6-Cysand8-Cyshepcidinsinotherspecieshavebeenstudied．Weconstructedhepcidin-GFPrecombinantplasmidstodetectthelocalizationofgrouperhepcidinsin