奶牛乳腺炎大肠杆菌优势血清型相关毒力基因与耐药基因的检测与序列分析

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1、奶牛乳腺炎大肠杆菌优势血清型相关毒力基因与耐药基因的检测与序列分析DetectionandSequenceAnalysisofCorrelativeVirulenceGenesandDrugResistanceGenesofSuperiorityEscherichiaColiSerotypesIsolatedfromCowMastiffs课题来源：国家科技支撑项目子课题课题编号：2012BADl2807．4独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中

2、特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得宁夏大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：触时间：≯哆年f月瑶日关于论文使用授权的说明本人完全了解宁夏大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意宁夏大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内

3、容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：j黾惹趁导师签名：专孑豇节导师签名：7吖多。彳时间：少f尹年了月彩日时间：≯，缈年J月髫日摘要本研究利用宁夏地区临床型奶牛乳腺炎大肠杆菌临床分离株，采用O抗原平板凝集试验鉴定大肠杆菌优势血清型，应用纸片扩散法对其耐药性进行分析，运用PCR方法对耐药基因以及毒力基因进行检测，并对血清型和耐药性之间的关系，以及卸2、iucA两种毒力基因的序列进行了分析比对，实验结果如下：1．根据GenBank报道的序列，设计大肠杆菌16SrRNA鉴定的通用引物，应用16S

4、rRNA鉴定大肠杆菌的方法，鉴定本实验室收集到的173株临床型奶牛乳腺炎肠杆菌科细菌，最终鉴定出107株大肠杆菌。2．根据相关文献报道，选取30种大肠杆菌O抗原血清，对107株奶牛乳腺炎大肠杆菌临床分离株进行O抗原血清鉴定。鉴定结果表明，107株奶牛乳腺炎大肠杆菌临床分离株中共有78株被鉴定出血清型，优势血清型有0101(15／78)、0158(15／78)，另外检出较多的有053(8／78)、010(7／78)、086(5／78)、092(6／78)，占定型株的71．8％，29株未定型。3．采用CLSI

5、推荐的纸片扩散法，对107株临床型奶牛乳腺炎大肠杆菌临床分离株进行了11种药物的药敏试验。结果表明，分离菌株对11种抗菌药物具有不同程度的耐药性，其中对复方新诺明耐药率达到94．4％，对四环素达到90．7％，对庆大霉素达到86．9％，对氨苄青霉素和阿莫西林均达到93．5％，另外对强力霉素，卡那霉素也达到60％以上，其他几种药物也达到较高水平。这107株大肠杆菌共出现53种耐药谱，并未出现1耐、2耐以及11耐的菌株。耐药类型最少的是0耐(仅1株)，最高的达到10耐。4．根据GenBank报道的相关序列，设计

6、磺胺类：sull、sul2、sul3；四环素类：tetA、tetB、tetE；氨基糖苷类：fladAl、aadA2、aadB、aadD、flacC2、flacC4、aac(3)．Ia、aac(3)．IIa、aph(3)．IIa；肛内酰胺类：CTX-M、SHV、OXA、nM：毒力基因：irp2、fyuA、eaeA、ler、F41、LTl、STl、iucA、iueB、iutA的PCR反应特异性引物，建立了相应的PCR检测方法。结果表明，该方法灵敏可靠，可以用作临床检测的方法使用。对107株奶牛乳腺炎大肠杆菌临

7、床分离株进行检测，共检测到14种耐药基因，7种毒力基因，分别为，sull(31．8％)、sul2(37．4％)、sul3(2．8％)、tetA(17．8％)、tetB(14．O％)、aacC2(32．7％)、aacC4(13．1％)、aadAl(9．3％)、fladA2(10．3％)、aadB(38．3％)、flag(3)-IIa(27．1％)、CTX·M(10．3％)、OXA(8．4％)、TEM(47．7％)、irp2(49．5％)、fyuA(49．5％)、ler(3．7％)、eaeA(3．7％)、iu

8、cA(38．3％)、iucB(56．1％)、iutA(49．5％)。而其他8种基因未检测到。5．对优势血清型0158、0101的30株大肠杆菌，分别扩增其trp2以及iucA两种基因并测序，之后对其序列进行分析，基因序列分析结果表明，两种基因与GenBank报道的序列同源性非常高，iqp2达到95．9％以上，而iucA达到98％以上。此外，两种基因的不同序列中均出现规律性的突变，其中卸2基因共出现6种序列，其中有3种序列均出现