奶牛乳腺炎葡萄球菌种类、毒力基因及抗性基因与耐药性的调查分析.pdf

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2、学学位巧ｆＮ期：年６巧叫泰據Ｖ４＇刮削剛会船公、識：：一＾＾＾Ｖ＊换’心友：＾１；抵徐佳奶牛乳腺炎葡萄球菌种类１、毒力基因及抗性基因与耐药性的调查分析＿奶牛乳腺炎葡萄球菌种类、毒力基因及抗性基因与耐药性的调查分析博±硏究生：徐佳导师：孙怀昌摘要乳腺炎是制约世界奶牛养殖业发展的最重要疾病之一。奶牛乳腺炎的病原微生物种类繁多，但Ｗ葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌为主，其中金黄色葡萄球菌是接触传染性病原菌，ｃｏａ－而且具有公共卫生意义；凝固酶阴性葡萄球菌（ｕｌａｓｅｎｅａｔｉｖｅｓｔａｈｌｏｃｏｃｃｉＣＮＳ）有ｇｇｐｙ，２０多种，

3、已成为许多国家奶牛乳腺炎的主要病原菌，但不同国家流行的ＣＮＳ种类不同。葡萄球菌毒力基因多达数十种，但具体的致病作用知之甚少。奶牛乳腺炎主要靠加强饲养、。管理和使用抗茜药物进行控制，但随着抗生素的长期盲目使用，细菌耐药现象日益严重国内对奶牛乳腺炎葡萄球菌的系统研究较少，本研究对乳腺炎葡萄球菌的种类、毒力基因、抗性基因及其与耐药表型的关系进行了系统的调查分析，旨在为奶牛乳腺炎葡萄球菌致病与耐药机制的深入研究奠定基础。一、奶牛乳腺炎葡萄球菌的分离与种类鉴定根据临床检查和乳汁体细胞检测结果，在２０１２年６月到２０１４年６月期间采集乳腺炎阳性奶样２０９份，接种血琼

4、脂平板培养后挑取疑似菌落，根据菌落形态和革兰氏染色镜检结果，筛选到１０４份葡萄球菌感染阳性奶样。在分离的１０４株葡萄球菌中，所有菌株均为过氧化氨酶试验阳性，２９株（２７．９％）为耐热核酸酶试验阳性，２７株（２６．０％）为凝固酶试验阳性，２４株（２３．１％）为耐热核酸酶基因检测阳性，２８株（２６．９％）为凝固酶基因检测阳性。综合上述结果，将２８株（２６．９％）初步鉴定为金黄色葡萄球菌７６株（７３．１％），鉴定为ＣＮＳ。用ＰＣＲ扩増葡萄球菌蛋白翻译化延伸因子（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ化ｆａｃｔｏｒＴｕｆ）和１６Ｓ，ｒＲＮＡ基因片段并进行序列测定，Ｗ同源性含９８％为种的

5、区分标准，将２８株确认为金黄色葡萄球菌，７６株ＣＮＳ分为１３个种，其中阿尔莱特葡萄球菌（Ｓ．ｗＶｅ化／ｅ）、松鼠葡萄球菌‘’（（．（．）ｉＳ．５Ｘ７Ｗ７）、木糖葡萄球菌ｉＳ巧／ｏｍｓ）和产色葡萄巧菌ｉＳｃ／ｚＡＷＭＯｇｅｎｅｙ为优势ＣＮＳ，’’５．分别占１．８％表皮葡萄球菌化ｅ卸成ｎｍ流５）、（ｉＳｗ／ｗｗ／ａｗ）、；模仿葡萄球菌马胃葡萄球’’茜（ｉＳｅｉｗｒＭＴＷ）、＆／ｗｗｎｏｚ）．ｇ溶血性葡萄球菌（如ｃＭＪ）和沃氏葡萄球菌ｗａｍｍ次之，猪葡萄球菌（Ｓ．吟ｋｗ）、腐生葡萄球菌（Ｓ．砂ｒｔｃｗ）、巧巧葡萄球菌（ｉＳ．沁Ｗ）和苍蜗葡萄球菌ｗｗｃａｅ）

6、为次要ＣＮＳ，各占１．３％。这些研究结果表明，葡萄球菌是Ｊ扬州大学博±学位论文该场奶牛乳腺炎的主要病原菌，并ＷＣＮＳ为主，但优势ＣＮＳ种类不同于国外报道；Ｔｕｆ基因序列分析可用于葡萄球菌种的鉴定，但少数菌株需用１６ＳｒＲＮＡ基因序列予Ｗ确认。二、奶牛乳腺炎葡萄球茜毒为基因的检测与分析将３７个葡萄球菌毒力基因分为普通毒力基因、外毒素基因和生物被膜形成基因。Ｗ一葡萄球菌基因组ＤＮＡ为模板进行单、双重或多重ＰＣＲ检测，结果在２８株金黄色葡萄球菌中，１４个普通毒力基因的检出率依次为凝固酶基因ＣＷ和免疫球蛋白结合蛋白基因／ｇ（１００％）、溶血素Ａ基因（９６．

7、４％）、溶血素Ｂ基因Ａ化和纤维蛋白原结合蛋白基因（９２．９％）、凝集因子Ａ基因Ｃ卿（８９．３％）、凝集因子Ｂ基因娜Ｂ和耐热核酸酶基因ｎｗｃ（８５．７％）、ＭＨＣＩＩ类分子类似物蛋白基因Ｗ邸（７８．６％）、莫膜多糖５基因〇（４６．４％）、７护芙膜多糖８基因ｃａｐｓ和弹性蛋白结合蛋白基因ｅ如（３９．３％）及胶原结合蛋白基因ＣＷ７（１０７２（１．、．％）１个外毒素基因的检出率依次为肠毒素Ｇ基因ｗｇ４３％）肠毒素Ｉ基因；（