宁波舟山港致病菌毒力相关基因挖掘与耐药分析

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1、分类号：UDC：密级：宁波一舟山港致病菌毒力相关基因挖掘及耐药分析论文答辩日期2013年3月8日答辩委员会主席吴月燕教授论文评阅人毛芝娟副教授答辩委员会成员吴月燕教授陈吉刚教授毛芝娟副教授浙江理工大学学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得浙江理工大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示射意。学位论文作者签名

2、：}◇朗及签字日期：矽，乡年弓月厂?El学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解浙江理工大学有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权浙江理工大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：^、夕工删及签字日期：沙吗年7月旧日导师签名：仍％签字日期：加％年；月／9El课题来源海洋公益性行业科研项目浙江理工大学宁波一舟山港致病菌毒力相关基因挖掘及耐药分析摘要副溶

3、血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一种广泛存在于海水近岸、贝类和鱼类等海洋生物中的革兰氏阴性嗜盐菌，也是引起食源性疾病最常见的致病菌之一。由副溶血弧菌引起的食物中毒，尤其在我国的沿海地区，副溶血弧菌引起的在食源性细菌中的比例一直占有较高比例，其主要是由于食用了加工不当而导致的污染了致病性副溶血弧菌的海产品而引起的食物中毒事件。致病性副溶血弧菌毒力基因是耐热性溶血素(TDH)或其同源性溶血素TRH，分别被基因tdh和trh编码。然而，从环境、海产品和临床中分离得到的致病性副溶血弧菌并不是所有的致病菌都包含有该基

4、因。研究显示，几乎所有的临床株都可产生神奈川现象(含TDH基因的副溶血弧菌可在我妻氏血平板上产生一种特殊的溶血现象)，此现象和TDH有密切相关。而环境中的菌株很少有神奈川现象，但若其含有tdh或trh则被认为是致病菌。副溶血弧菌对宿主的致病性与副溶血弧菌产生的各种毒力因子息息相关，对这些毒力因子及相关基因的研究已广泛引起研究者足够的兴趣。其中包括tdh、gyrB、tlh和toxR等基因。．溶藻弧菌(Vibrio口细nolyticus)是广泛分布于河口和海洋的革兰氏阴性菌，是海洋动物和人共染的一种致病菌。致病性的溶藻弧菌是危害大黄鱼

5、最严重的病原菌。大黄鱼是中国海产经济鱼类中最为重要的，从而对水产养殖造成巨大经济损失。溶藻弧菌会引起败血症、炎症反应、伤口感染等症状，同时也是腹泻病原菌中的一员，流行范围广，发病率高。溶藻弧菌产生的各种毒力因子，目前研究的有胶原蛋白酶基因、铁摄取调节基因、碱性丝氨酸蛋白酶基因和鞭毛丝蛋白基因，毒力基因的调控基因以及调控的目的基因。气单胞菌属是常见的致病菌，在自然界中分布广泛。由嗜水气单胞菌引起的疾病种类繁多，其中包括出血症、腹水病等。这些疾病给水产养殖带来了严重的经济损失，并且还能通过水产养殖动物和海产品感染人类。抗生素一直被认为

6、是治疗由致病菌引起的此类疾病的良药，但随着抗生素的大量使用，该致病菌的耐药株不断出现，由此给人类带来了较大的困扰。因此，研究副溶血弧菌、溶藻弧菌和嗜水气单胞菌的耐药性、致病性、表型和毒力基因之间的相互关系，明晰其致病机理，继而获得有效抑制其致病力的方法具有重大意义。本研究主要从致病性副溶血弧菌、溶藻弧菌和嗜水气单胞菌的毒力相关基因着手，通过PCR技术对已报道的毒力及相关基因进行检测、测序和克隆保藏。结果从副溶血弧菌中浙江理工大学宁波一舟山港致病菌毒力相关基因挖掘及耐药分析扩增到毒力相关基因gyrB、tm和toxR，从溶藻弧菌中扩增

7、分离到毒力相关的胶原蛋白酶基因、碱性丝氨酸蛋白酶基因、鞭毛丝蛋白基因和铁摄取调节基因，从嗜水气单胞菌中分离到气溶素基因和肠毒素基因。最后，对致病性副溶血弧菌、溶藻弧菌和嗜水气单胞菌的常见耐药性进行了检测，结果表明：副溶血弧菌对万古霉素具有耐药性，对11种抗生素高度敏感；溶藻弧菌对青霉素、万古霉素高度耐药，对9种抗生素高度敏感。嗜水气单胞菌具有多重耐药性，对利福平、新生霉素、大环内酯类(2种)抗生素、新霉素、头孢噻呋、四环素7种抗生素高度耐药，其对7种抗生素高度敏感。通过分析了耐药性与致病性表型之间的关系，对抗生素的使用、致病机理和

8、来源都有重要意义。关键词：副溶血弧菌；溶藻弧菌；嗜水气单胞菌；PCR；毒力基因；克隆ll浙江理工大学宁波一舟山港致病菌毒力相关基因挖掘及耐药分析AbstractVibrioparahaemolyticusisahalophilicGram-nega