tgf-βbmp应答元件表达载体的构建及功能检测

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1、分类号R6密级公开UDC610硕士学位论文TGF-β/BMP应答元件表达载体的构建及功能检测学位申请人：沈旭学科专业：外科学指导教师：宋兴福教授吴江锋教授二○一三年五月ADissertationSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofMedicineConstructionandIdentificationofEukaryoticVectorofTGF-β/BMPRespontiveElementsGr

2、aduateStudent:ShenXuMajor:SurgerySupervisor:Prof.SongXingfuProf.WuJiangfengChinaThreeGorgesUniversityYichang,443002,P.R.ChinaMay,2013三峡大学硕士学位论文三峡大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡

3、献的个人和集体均已在文中以明确方式标明，本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。学位论文作者签名：日期：三峡大学研究生知识产权承诺书本人承认：我作为三峡大学硕士研究生在校学习期间，在导师指导下，依据研究工作所作学位论文的知识产权全部权归三峡大学所有。本人承诺：我有义务维护三峡大学的知识产权，凡是以我本人学位论文内的全部或部分研究成果，或实验数据为基础所形成的研究论文及成果，无论是以何种形式刊发学术论文、进行成果鉴定或申报奖励，均以三峡大学为第一作者单位或完成单位，并事先征得导师或学校相关部门的同

4、意。我愿承担因违背上述承诺而引起的一切法津和经济后果。学位论文作者签名：日期：I三峡大学硕士学位论文内容摘要目的：构建TGF-β应答元件真核表达载体pGLuc-TRE-Mini-TK，BMP应答元件真核表达载体GLuc-(BRE)2-Mini-TK和pGLuc-9×(GCCG)-Mini-TK，为实现筛选与纤维化密切相关的转录因子，进行干预性靶向治疗纤维化的目的奠定实验基础。方法：通过分子生物学技术设计TGF-β/BMP应答元件，并构建相应真核表达载体pGluc-TRE-Mini-TK、pGluc

5、-(BRE)2-Mini-TK和pGluc-9×(GCCG)-Mini-TK。然后通过脂质体分别将pGluc-TRE-Mini-TK转染到小鼠成纤维L929细胞内，并采用持续活化型受体激活素受体样激酶5(activinreceptor-likekinase5,ALK-5)激活含有TGF-β应答元件细胞的TGF-β信号；将pGluc-(BRE)2-Mini-TK和pGluc-9×(GCCG)-Mini-TK分别转染到大鼠HSC-T6细胞内，用ALK-3激活含有BMP应答元件细胞的BMP信号。然后通过

6、荧光检测技术检测培养细胞上清中的Gluc表达情况，以确认TGF-β/BMP应答元件的功能。结果：(1)酶切鉴定和测序分析证实TGF-β/BMP应答元件TRE、(BRE)2以及9×(GCCG)碱基序列、插入方向和阅读框架均正确。(2)将TGF-β/BMP应答元件真核表达载体分别转染入相应细胞后，经免疫荧光检测，可见培养上清中荧光素酶GLuc大量表达。结论：本研究成功构建了TGF-β/BMP应答元件表达载体。为实现筛选与纤维化密切相关的转录因子，进行干预性靶向治疗纤维化的目的奠定实验基础。关键词：纤维

7、化应答元件质粒构建三峡大学硕士学位论文AbstractObjectiveToconstructpGLuc-TRE-Mini-TKeukaryoticvectorofTGF-βrespontiveelementsandpGLuc-(BRE)2-Mini-TKandpGLuc-9×(GCCG)-Mini-TKeukaryoticexpressionvectorsofBMPrespontiveelements.MethodsALK5stimulateTGF-βsignalinginthevectorsp

8、GLuc-TRE-Mini-TKwhichwastransfectedintomouseL929withLipofectamineTM2000;ALK3separatedrespectivelystimulateBMPsignalinginthevectorspGLuc-9×(GCCG)-Mini-TKandpGLuc-(BRE)2-Mini-TKwhichweretransfectedintoratHSC-T6withLipofectamineTM2000.anddetectth