敲低ABCG1慢病毒表达载体的构建及功能检测.pdf

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1、巾国心血管杂志2014年8月第l9卷第4期ChinJCardiovascMed，Auz'ust2014．Vo1．19．No．4·277·．基础研究．敲低ABCG1慢病毒表达载体的构建及功能检测刘芳王伟陈连凤方全严晓伟【摘要】目的为探讨人急性单核细胞白血病细胞系(THP一1)中胆固醇转运相关的ABCG1基因的表达对动脉粥样硬化发生发展的作用，构建ABCGI慢病毒干扰载体，并验证干扰效果、进行功能检测。方法针对人ABCG1的cDNA序列，设计两个RNA干扰的寡核苷酸单链DNA。将其插入到慢病毒表达载体上；将构建的载体和包装质粒共转染293T细胞：通过实时荧光定量PCR及蛋白质免疫印迹检测干

2、扰载体对ABCG1表达水平的影响；通过检测外流率进行功能验证。结果构建的ABCG1基因的小干扰RNA慢病毒表达载体感染THP一1细胞可以有效地抑制ABCG1mRNA和蛋白表达水平，且减少ABCG1介导的胆固醇外流，感染组外流率小于对照组(23。87％-4-0．45％比30．57％±1．00％，P<0．001)。结论慢病毒表达载体成功敲低THP．1细胞的ABCG1，并为后续的ABCG1在巨噬细胞中生物学作用的研究创造条件。【关键词】ABCG1；慢病毒载体；RNA干扰ConstructionofalentiviralvectorofABCG1shorthairpinRNAandfuncti

3、ondetectionLiuFnng，WangWei，ChenLianfeng，FangQuan，YahXiaoweLDepartmentofCardiology，PekingUnionMedicalCollegeHospital，PekingUnionMedicalCollege，ChineseAcademyofMedicalScience，Belting100730，ChinaCorrespondingauthor：YanXiaowei，Email：xswy_pumc@163．eomThiswork珊supportedbyagrantfromtheNationalNaturalSc

4、iencesFoundationofChina(No．81270381)．【Abstract】ObjectiveToinvestigatethebiologicalfunctionofhumanlipidtransportergeneABCG1inTHP一1celllineinthedevelopmentandprogressionofatherosclerosis，thelentiviralvectorofABCG1shorthairpinRNA(shRNA)wasconstructedanditsknockdowneffectandfunctionwasdetermined．Met

5、hodsABCG1shRNAwasdesignedandconstructedbasedhumanABCG1cDNAsequenceusingalentiviralvector．TheexpressionofABCG1wasmeasuredbyreal—timePCRandWesternblot，andfunctionwasexaminedbyCholesteroleffluxassay．ResultsConstructoflentiviralvectoreffectivelyinhibitedABCG1mRNAandproteinlevelsanddecreasedtheABCG1一

6、mediatedcholesteroleffluxfromTHP一1一derivedmacrophages．(infectiongroup：23．87％±0．45％US．controlgroup：30．57％±1．00％，P<0．001)．ConclusionsAlentivirusRNAinferencevectortargetingABCG1geneissuccessfullyconstructed，whichprovidedTHP一1cellmode1forfurtherdetectionofABCGlfunction．【Keywords】ABCG1；Lentivirusvect

7、or；RNAinterferenceABCG1是三磷酸腺苷结合盒转运体超家族中方式转运各种物质包括外源化学物质、多肽和脂质的一员。它们遍及多个种类，包括细菌、鱼、鸟和哺等。临床和动物实验提示，ABCG1在动脉粥样硬化乳动物。它是一种跨膜糖蛋白，经膜以ATP依赖的的发生发展过程中可能发挥重要的作用l1-3]。ABCG1对维持细胞内胆固醇和脂质平衡起着至关DOI：10．3969／j．issn．100％5410．2014．04．009重要的作用[4-