表达microRNA-203tough decoy的慢病毒载体构建及应用.pdf

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1、天津医药2014年10月第42卷第10期961细胞与分子生物学表达microRNA-203toughdecoy的慢病毒载体构建及应用刘涛王玉亮宋红丽付楠楠吴本娟沈中阳【摘要】目的建立表达microRNA(miRNA)toughdecoy(TuD)的慢病毒载体构建方法，并检测其对细胞内miRNA表达水平及细胞表型的影响。方法在慢病毒表达质粒pSIH1一H1-eopGFP中通过两步克隆，首先构建miRNATuD通用骨架质粒，进一步构建特异性针对大鼠miR一203的TuD表达载体。在293T细胞中包装成慢病毒后，感染大鼠骨髓间充质干细胞(BM—MSCs)，同时用pSIH1一H1

2、一copGFP空质粒包装慢病毒，感染BM-MSCs作为对照。定量RT—PCR检测细胞中miR一203的水平变化，并用CCK-8法和AnnexinV-PI双标记法分别检测BM-MSCs的活性和凋亡。结果成功构建了基于pSIH1一H1一copGFP质粒的miR一203TuD表达载体，并对其序列进行了验证。用表达miR一203TuD的重组慢病毒感染BM—MSCs后第3、6、9天检测细胞内源性miR一203表达水平降低，同时细胞活性增高，凋亡比例降低，与对照组相比差异有统计学意义。结论两步克隆法构建miRNATuD表达载体是一种简便高效的方法，其表达产物能够有效抑制细胞内源性mi

3、RNA水平，同时影响细胞表型。【关键词】间质干细胞；慢病毒属；遗传载体；质粒；细胞凋亡；微RNAs；细胞活性；miRNA-203toughdecoy【中图分类号】Q78【文献标志码】A【DOI】10．3969~．issn．0253-9896．2014．10．001ConstructionandApplicationofLentiviralVectorsExpressingmicroRNA‘‘203ToughDecoyLIUTao1,2WANGYuliang，SONGHongli2,FUNannan，wUBenjuan，SHENZhongyangKeyLaboratoryf

4、orCriticalCareMedicineoftheMinistryofHealth，TianjinFirstCenterHospital，Ⅱ300384，China；2TheOrganTransplantCentet‘，TianjinFirstCenterHospital；3TheFirstCenterClinicalCollege，TianjinMedicalUniversityCorrespondingAuthorE—maihshenzy2014@163．com_【Abstract】ObjectiveToestablishmethodofconstructingl

5、entiviralvectorstoexpressmicroRNA(miRNA)"toughdecoy(TuD)andtodetecttheeffectsoftheTuDoncellularendogenousmiRNAlevelandcellularphenotypes．MethodsTwo—stepcloningstrategywasutilizedtofirstgenerateauniversalmiRNATuDframevector，followedbycon—structingtheTuDexpressionvectorspeciallytargetingmiR

6、一203．Thepackageoftherecombinantlentiviruswasper—Iformedin293Tcells．Thentheratbonemarrowmesenchymalstemcells(BM—MSCs)wereinfectedbythemiR．203TuDexpressionlentivirus．ThepSIH1一H1一copGFPvectorwasalsopackagedandtheBM—MSCsinfectedbythislentiviruswereservedascontro1．EndogenousmiR一203levelinBM—MS

7、CswasmeasuredbyquantitativeRT—PCR．andcellularvi—abilityandapoptosisweredetectedbyCCK一8testandAnnexinV—PIstainingrespectively．ResultsThemiR一203TuDexpressionvectorwassuccessfullyconstructedandinsertedsequencewasvalidated．Atthe3rd，6thand9thdaysafterin—feetedbythemilt．2