BMP-2、TGF-β3重组腺病毒载体的构建及其在滇南小耳猪BMSCs中的表达-论文.pdf

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1、·896·ChineseJournalofReparativeandReconstructiveSurgery,July2014，Vo1．28，No．7·干细胞与组织工程·BMP一2、TGF—I3l3重组腺病毒载体的构建及其在滇南小耳猪BMSCs中的表达王鑫李彦林金耀峰陈建明王慧建何川曹树海赵沣凯【摘要】目的构建含BMP．2和TGF．B基因的重组腺病毒载体，双基因共转染滇南小耳猪BMSCs并检测其表达，为组织工程软骨支架提供改良的种子细胞。方法用PCR方法扩增人BMP．2和TGF．目的基因，将2个基因亚克隆至穿梭载体pEC3．1(+)中，构建pEC．GIE3．1．BMP．2和pEC．GIE3

2、．1-TGF．13重组质粒，通过体外同源重组反应将pEC．GIE3．1-BMP．2、pEC．GIE3．1．TGF．13重组至腺病毒骨架质粒pGSadeno中，构建重组腺病毒表达质粒pGSadeno．BMP．2、pGSadeno．TGF-13，线性化后转染HEK293细胞进行包装，获得重组腺病毒Ad．BMP．2和Ad．TGF．13。取成年滇南小耳猪的骨髓，采用离心加贴壁法分离BMSCs，分别用基因Ad．BMP．2(A组)、Ad．TGF．D(B组)和Ad．BMP．2+Ad．TGF．13(C组)转染，以未转染细胞作为对照(D组)。采用免疫荧光、Westernblot、PCR检测目的基因和蛋白表达，

3、II型胶原免疫组织化学染色观察成软骨分化情况。结果Ad．BMP．2和Ad．TGF．13经PCR及测序鉴定正确，带BMP．2、TGF．13基因的载体在HEK293细胞中包装成功，病毒滴度分别为5．6×l0s、1．6x108pfu／mL。双基因共转染滇南小耳猪BMSCs72h后，PCR示A组在310bD处可见条带，B组在114bp处可见条带，C组在310、114bp处同时可见条带，D组未见目的条带表达；免疫荧光示A、B组细胞质内有分别有红色、绿色荧光表达，C组同时表达红色及绿色荧光，D组未见荧光表达；Westernblot示A组在相对分子质量为18x103处有阳性条带，B组在50×103处有阳性

4、条带，C组在18×103、50x103处同时可见条带，D组未见目的条带表达。II型胶原免疫组织化学染色示A、B、C组呈阳性，C组染色强于A、B组，D组染色呈阴性。结论成功构建含BMP．2和TGF．13基因的重组腺病毒载体。Ad．BMP．2和Ad．TGF．p3双基因联合转染滇南小耳猪BMSCs后目的基因和蛋白均可成功表达，并促进BMSCs成软骨分化，可作为组织工程软骨研究的改良种子细胞。【关键词】组织工程软骨腺病毒BMSCs基因转染BMP．2TGF．13猪CONSTRUCTIONANDlDENTIFICATIONOFADENOVlRUSVECT0REXPRESSlNGB0NEM0RPHOGEN

5、ETICPROTEIN2ANDTRANSFORMINGGROWTHFACTORBGENESANDTHEIREXPRESSlONlNBONEMARROWMESENCHYMALSTEMCELLSOFDIANNANSMALL-EARPlGS／WANGXin，LIYanlin，IINYaofe，CHENJianming／，WANGHuijian，HEChuan，CAOShuhai，ZHA0Fengkai．DepartmentSporuMedicine,theFirstAffiliatedHospital0lKunmingMedicalUniversity,KunmingYunnan650032．P．

6、R．China；2Departmento{Orthopaedics,thePeople'sHospitalo{liaxingCity；3DepartmentOrthopaedics,theSecondPeople'sHospital0jHunanProvince．Correspondingauthor：LIYanlinE—mail：852387873@qq．com[Abstract]0bjectiveToconstructandidentifytherecombinantadenovirusvectorexpressingbonemorphogeneticprotein2(BMP一2)and

7、transforminggrowthfactor133(TGF一133)genes，toobservetheexpressionsofBMP一2andTGF一133aftertransfectedintobonemarrowmesenchymalstemcells(BMSCs)oftheDiannansmall—earpigs．MethodsBMP一2cDNAandTGF．13cDNAwereamplifie