鱼类海豚链球菌流行病学及诊断技术的研究

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1、中山大学博士学位论文鱼类海豚链球菌流行病学及诊断技术的研究姓名：周素明申请学位级别：博士专业：水生生物学指导教师：谢明权20100610鱼类海豚链球菌(Streptococcusiniae)流行病学及诊断技术的研究专业：水生生物学博士生：周素明指导老师：谢明权教授中文摘要链球菌病是近几十年新出现的一种世界性鱼类细菌病。全球每年鱼链球菌病造成的经济损失已超过1．5亿美元。该病在各大洲的主要鱼类养殖国家均有发生，在温带和热带、亚热带地区尤其严重。链球菌能危害几乎所有的海、淡水养殖鱼类，包括养殖中的重要品种如罗非鱼、虹鳟、美国红鱼、鲫鱼、牙鲆、

2、大菱鲆、条纹鲈等多种鱼类。自20世纪90年代以来，我国鱼类链球菌感染的报道也日趋增多，在养殖的罗非鱼、虹鳟、大菱鲆、牙鲆、红鳍东方纯、白鲳和美国红鱼中都有报道，并以罗非鱼最为严重，发病率一般达20-30％，发病鱼死亡率达95％以上。本论文通过对广东省养殖鱼类细菌流行病学调查研究及病原菌的分离鉴定，发现海豚链球菌是网箱养殖鱼类及淡水养殖罗非鱼的首要病原菌。通过调查发现，海豚链球菌能够感染多种养殖鱼类，包括已经报道过的美国红鱼、罗非鱼和篮子鱼，和一些尚未报道的本地鱼种包括花尾胡椒鲷、红鳍笛鲷、平鲷、卵圆鲳鳕、布氏石斑和金钱鱼。而在这些海水养殖

3、鱼类中，海豚链球菌病在卵圆鲳鳄中最为常见，其次是鲷科鱼类和鳍科鱼类。网箱养殖的海水鱼类在水温较高的6-9月份集中爆发，但淡水养殖罗非鱼在水温较低的11和12月份也会爆发。海豚链球菌疫苗已经成为各个鱼类养殖大国研究的热点，尽管如此，有关海豚链球菌不同菌株的血清型的研究较少，海豚链球菌存在几种血清型也不明确。本论文从分离的26株海豚链球菌菌株中选取6株并分别制备了其罗非鱼抗血清，并用微量凝集的方法对海豚链球菌26株广东分离株及1株浙江分离株和l株国外标准株进行交叉凝集反应。根据交叉凝集反应结果，首次发现中国海豚链球菌不同分离株中存在2种血清学

4、类型。另外，利用脉冲场电泳(PulsedFieldGelElectrophoresis，PFGE)的方法对所分离的海豚链球菌菌株进行分子分型，结果显示，包括标准株及浙江分离株在内的28株海豚链球菌中，共获得了18种不同的PFGE带型。通过对这些菌株的PFGE图谱的聚类分析，发现这些分离株大致分为五个小群，三个大的分支。其中北美分离的标准株ATCC29178单独成为一个分支，而中国分离株聚类成两个大的分支。在分子诊断方面，我们对10株不同的海豚链球菌菌株的ITS序列进行扩增、测序、同源比对及分析，并设计出一对特异引物SPl和SP2。这对引物

5、能特异地扩增出377bp海豚链球菌ITS片段，而对其亲缘关系较近的鱼类病原链球菌和一些常见的淡海水鱼类病原菌及一些其它细菌都不能扩增出任何的片段。说明该引物具有较好的特异性，特别是克服了其他海豚链球菌特异引物对无乳链球菌不特异的缺点。灵敏度结果表明，该特异引物在细菌个数为9个或DNA量为20pg时仍能扩增出阳性结果，这个结果均要比其他特异引物的灵敏度要高。除了特异PCR的方法，本研究首次建立海豚链球菌LAMP检测方法。首次从海豚链球菌不同菌株中中克隆得到海豚链球菌的助溶血因子基因(CAMPfactor，驴gene)的全阅码框，并以此为靶序

6、列，通过在线设计软件PrimerExploreversion3software设计了一系列引物，并筛选出了一组特异性较强的引物。结果表明，我们建立的LAMP反应体系具有较好的特异性和较高的灵敏度，DNA模板量为lpg时，仍可扩增出阳性结果，比特异PCR的方法灵敏度要高20．100倍。将以上两种海豚链球菌的分子诊断技术用于对73个样本进行检测。结果发现，用传统的细菌分离方法，只得到了6个阳性结果，且因为多了细菌培养的过程，比较费时；而利用所建立的海豚链球菌特异PCR技术却获得了18个阳性结果；利用所建立的海豚链球菌特异LAMP技术获得了26

7、个阳性样本。其中，用细菌分离培养鉴定方法得到的6个阳性结果，用特异PCR及LAMP的方法均显示阳性结果。用特异PCR方法检测得到的18个阳性样本，用LAMP的方法均II显示阳性结果。以上结果表明，所建立的两种分子诊断技术跟传统细菌分离的结果具有较好的吻合度；其次两种分子诊断技术的灵敏度都远远高于传统的细菌分离培养；最后，LAMP技术在鱼类样本中海豚链球菌的检测上灵敏度比特异PCR技术要高。综上所述，本研究所建立的特异PCR方法及LAMP将为海豚链球菌病的早期诊断及预防提供较好的方法和科学依据。关键字：流行病学，海豚链球菌，血清型，脉冲场电

8、泳，特异PCR，环介导恒温扩增技术，分子诊断IIIStudyofepidemiologyanddiagnosistechniqueofMajor：HydrobiologyName：Suming