海豚链球菌camp因子原核表达及生物学特性研究

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1、万方数据C1assifica60nNumber．．8．．．．9．．．4．．．．!．．．．．4．—2—SichuanAgriculturalUniversityMasterDegreeDissertationProkaryoticexpressionandCharacterAnalysisofStreptococcusiniaeCAMPfactorByXiaoMengweiDirectedbyProf．WangKaiyu(BasicVeterinaryMedicine)Sichuan，Ya’an，ChinaMay，2014万方数据论文独创性声明、本人郑重声明：所呈交的学位论文是

2、我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得园川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名舱牵矽lV年易月驴口关于论文使用授权的声明奉人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体

3、上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：‘百南讳蝴⋯夕抄p彤年‘月g日wf≯年，月鬈日万方数据摘要本研究以斑点叉尾鲴源海豚链球菌(Streptococcusiniae，&iniae)广西分离株DGX07为实验菌株提取总DNA作为模板，对CAMP因子基因进行PCR(PolymeraseChainReaction)扩增；将扩增产物连接至pMDl9-T质粒中进行测序，并应用不同的生物信息学软件对其核酸及氨基酸序列进行分析；将含有限制性内切酶位点的c彝基因连接至pMDl9-T质粒中，酶切回收后将其连接至表达质粒pET32a(+)上，最终转化至大肠杆菌(Escherichia

4、coli，三coli)原核表达系统BL21(DE3)大肠杆菌内；将阳性表达菌株进行CAMP因子重组诱导表达，并优化表达条件；用重组CAMP因子蛋白免疫新西兰大白兔，并进行Western．blot以检验该蛋白的免疫原性以及在海豚链球菌中的表达情况；用Western．blot检验重组CAMP因子对IgG非特异性的粘附：用CAMP因子抗血清探究其对海豚链球菌对鲤鱼上皮瘤细胞(Epitheliomapapulosumcyprini，EPC)粘附及侵染的抑制水平；用重组CAMP因子与重组金黄色葡萄球菌(Staphytococcusaureus)鞘磷脂酶(sphingomyelinase

5、)探究其对不同物种血细胞的促溶血特性。核酸及蛋白质序列分析表明，海豚链球菌CAMP因子隶属于CAMP因子超家族，并与其他链球菌CAMP因子同源，但是其与亲缘关系最近的犬链球菌(Streptococcuscanis)的相似度仅为63％，且该蛋白质含有60．1％的可变氨基酸，这表明海豚链球菌CAMP因子不属于保守蛋白质；NCBI在线预测软件分析表明，CAMP因子含有信号肽序列，1个潜在N．糖基化位点，以及16个潜在磷酸化位点；SDS．PAGE显示，海豚链球菌重组CAMP因子的蛋白大小为48kDa，且大肠杆菌原核表达系统在IPTG浓度为0．8mmol／L、37"C下诱导表达5h时，

6、表达水平达到最大；琼脂扩散实验结果表明，CAMP因子抗血清效价为1：32；Western-blot结果显示，重组CAMP因子具有抗原性，且海豚链球菌存在CAMP因子的表达；细胞实验中，被CAMP因子抗血清中和了的海豚链球菌显示出粘附以及入侵鲤鱼上皮瘤细胞能力减弱的现象，其中粘附水平下降至58．4％，而侵入水平下降更多，至42．7％，这表明CAMP因子在海豚链球菌侵入机体后粘附并进入上皮细胞中起着较为重要的作用；Western—blot结果显示，a一烯醇化酶抗血清与CAMP因子预孵育后，其与Q．烯醇化酶结合的能力出现下降，这表明CAMP因子能够非特异性地结合兔源IgG；对不同种

7、红细胞的促溶血结果显示，万方数据重组CAMP因子对羊、猪以及兔血红细胞的促溶血程度呈剂量以及时间相关性；而两种鱼类血细胞则对CAMP因子的促溶血作用呈完全抵抗的现象。综上所述，海豚链球菌CAMP因子可能丧失了对鱼类细胞的促溶血作用，而其在非特异性结合IgG，以及协助海豚链球菌粘附并侵染鱼类上皮细胞的过程中，CAMP因子则起着较为重要的作用。关键词：海豚链球菌；CAMP因子；序列分析；克隆表达；生物特性探究万方数据AbswactInthisstudy，totalbacterialDNAofwasextra