剪接因子srp55原核表达质粒的构建和表达

《剪接因子srp55原核表达质粒的构建和表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、剪接因子SRp55原核表达质粒的构建和表达编辑。【摘要】目的：本研究通过扩增剪接因子SR蛋白家族的SRp55基因，构建GST融合蛋白原核表迗质粒pGEX-2T/SRp55,并在大肠杆菌中诱导表达并进行纯化。方法：用PCR法扩增SRp55基因，将扩增产物和载体pGEX-2T进行双酶切后回收，连接载体和目的片段，获得重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌BL21。在大肠杆菌BL21中通过IPTG进行诱导表达，然后用谷胱甘肽-琼脂糖球珠，亲和纯化得到纯的GST-SRp55融合蛋白。结果：SRp55基因以正确的阅读框架插入PGEX-2T。IPT

2、G诱导大肠杆菌BL21表迗，随诱导时间的增加蛋白表迗量增高，4h以后接近最高表迗量。通过亲和纯化得到分子量在60kD左右的蛋白，经蛋白印迹分析证实为GST-SRp55融合蛋白。结论：成功地构建了GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-2T/SRp55,并获得GST_SRp55融合蛋白，为进一步研究tau蛋白可变剪接机制提供了必要的基础。【关键词】SRp55Tau原核表达剪接因子[Abstract]Objective：ToexpressandpurifyGlutathioneSTransferaEinofSRp55,asplicieth

3、ods：ThecDNAofSRolymerasechainreacse(GST)-fusionprotngfactor,incells.Mp55wasamplifiedbyption(PCR)andinsertedintopGEX-2TwithBctionsites.TherecoEX-2T/SRp55wastranexpressGST-SRp55.T55inthecellswaspurtbyaffinitypurificST-SRp55wasanalyzernblot.Results：ThetopGEX~2Twithcorree

4、expressionofGST-Sbyaddinglsopropyl3ranoside(IPTG)inaer.TheexpressionleestafteraddingIPTGiedGST~SRp55byglutsebeadsshoweda^60ksiebluestaining,whedbyanti-GSTantiboSRp55isexpressedandpurifiedsuccessfuwhichwillhelpustofurthenoftausplicing.amHlandEcoRlrestrimbinantplasmidof

5、pGsformedintocellstoheexpressedGST-SRpifiedfromtheextracation.ThepurityofGdbySDS-PAGEorWesteSRp55wasinserted!nctopenreadframe.ThRp55couldbeinduced-D-l-thiogalactopytime-dependentmannvelachievedthehighfor4hours.Thepurifathione(GSH)-agaroDmajorbandbycoomasichalsowasreco

6、gnizdy.Conclusion:GST-llyfromcellsrstudytheregulatio[Keywords]SRp55；Tau；Prokaryoticexpression整个人类DNA序列分析的完成使得我们认识到真正参与编码的基因只有2万多个［1］，远低于原来预料的10万个。其中60°/。的基因可通过不同的剪接产生多个剪接变异体，从而使得人类蛋白质更加多样［2］。不同的剪接产物是顺式作用元件和反式作用因子共同作用的结果。反式作用因子是指与DNA或RNA作用并调节其转录、剪接和翻译的蛋白质总称。参与RNA剪接的反式作

7、用因子主要包括SR和hnRNP家族蛋白两大类。SR蛋白家族是一高度保守的剪接因子家族，它其在羧基端富含精氨酸/丝氨酸二肽结构的结构域而得名［3］。SR蛋白通过它带有的1个或2个拷贝的RNA识别基序与RNA结合，并决定各SR蛋白的底物特异性，因此RS结构域介导蛋白之间的相互作用［4］。Tau蛋白是存在于神经元中主要的微管相关蛋白，其功能是促进微管聚合和稳定微管结构。在正常人脑中，tau蛋白有6种变异体，而这6种变异体是由单一的基因编码通过不同的剪接而形成的。其中，外显子10的编码与否决定了tau蛋白含有4个或3个微管结合重复片断［5

8、］。在正常人脑中，3R和4R的比例大约是1:1，但在某些17号染色体连锁性前额颞叶痴呆合并帕金森综合征(FTDP_17)的病人脑中，由于某些突变引起外显子10的编码，使得4R和3R的比例大于1［6］。而在某些神经退行性疾病中，由于tau基因第280