剪接因子SRp55原核表达质粒的构建和表达.doc

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1、剪接因子SRp55原核表达质粒的构建和表达【摘要】目的：本研究通过扩增剪接因子SR蛋白家族的SRp55基因，构建GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-2T/SRp55，并在大肠杆菌中诱导表达并进行纯化。方法：用PCR法扩增SRp55基因，将扩增产物和载体pGEX-2T进行双酶切后回收，连接载体和目的片段，获得重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）。在大肠杆菌BL21（DE3）中通过IPTG进行诱导表达，然后用谷胱甘肽-琼脂糖球珠，亲和纯化得到纯的GST-SRp55融合蛋白。结果：SRp55基因以正确的阅读框架插入pG

2、EX-2T。IPTG诱导大肠杆菌BL21（DE3）表达，随诱导时间的增加蛋白表达量增高，4h以后接近最高表达量。通过亲和纯化得到分子量在60kD左右的蛋白，经蛋白印迹分析证实为GST-SRp55融合蛋白。结论：成功地构建了GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-2T/SRp55，并获得GST-SRp55融合蛋白，为进一步研究tau蛋白可变剪接机制提供了必要的基础。【关键词】SRp55Tau原核表达剪接因子[Abstract]Objective:ToexpressandpurifyGlutathioneSTransferase(GS

3、T)-fusionproteinofSRp55,asplicingfactor,inE.colicells.Methods:ThecDNAofSRp55wasamplifiedbypolymerasechainreaction(PCR)andinsertedintopGEX-2TwithBamH1andEcoR1restrictionsites.TherecombinantplasmidofpGEX-2T/SRp55wastransformedintoE.colicellstoexpressGST-SRp55.Theexpre

4、ssedGST-SRp55intheE.colicellswaspurifiedfromtheextractbyaffinitypurification.ThepurityofGST-SRp55wasanalyzedbySDS-PAGEorWesternblot.Results:TheSRp55wasinsertedintopGEX-2Twithcorrectopenreadframe.TheexpressionofGST-SRp55couldbeinducedbyaddingIsopropylβ-D-1-thiogalact

5、opyranoside(IPTG)inatime-dependentmanner.TheexpressionlevelachievedthehighestafteraddingIPTGfor4hours.ThepurifiedGST-SRp55byglutathione(GSH)-agarosebeadsshoweda~60kDmajorbandbycoomassiebluestaining,whichalsowasrecognizedbyanti-GSTantibody.Conclusion:GST-SRp55isexpre

6、ssedandpurifiedsuccessfullyfromE.colicells，whichwillhelpustofurtherstudytheregulationoftausplicing.[Keywords]SRp55；Tau；Prokaryoticexpression整个人类DNA序列分析的完成使得我们认识到真正参与编码的基因只有2万多个[1]，远低于原来预料的10万个。其中60％的基因可通过不同的剪接产生多个剪接变异体，从而使得人类蛋白质更加多样[2]。不同的剪接产物是顺式作用元件和反式作用因子共同作用的结果。反

7、式作用因子是指与DNA或6RNA作用并调节其转录、剪接和翻译的蛋白质总称。参与RNA剪接的反式作用因子主要包括SR和hnRNP家族蛋白两大类。SR蛋白家族是一高度保守的剪接因子家族，它因其在羧基端富含精氨酸/丝氨酸（arginine/serine）二肽结构的结构域（RSdomain）而得名[3]。SR蛋白通过它带有的1个或2个拷贝的RNA识别基序（RRM）与RNA结合，并决定各SR蛋白的底物特异性，因此RS结构域介导蛋白之间的相互作用[4]。Tau蛋白是存在于神经元中主要的微管相关蛋白，其功能是促进微管聚合和稳定微管结构。在正

8、常人脑中，tau蛋白有6种变异体，而这6种变异体是由单一的基因编码通过不同的剪接而形成的。其中，外显子10的编码与否决定了tau蛋白含有4个或3个微管结合重复片断（4repeatsor3repeats,4R或3R）[5]。在正常人脑中，3R和4R的比例大约是1∶1，但在某些1