猪链球菌血清2型分子诊断技术的研究及初步应用论文

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1、河南农业大学2012届硕士毕业论文摘要猪链球菌病是一种严重危害养猪业的重要传染病，可引起猪的脑膜炎、关节炎、败血症、心内膜炎和中毒休克综合征等，给养殖业造成很大的经济损失。猪链球菌是世界范围内引起猪链球菌病的最主要的病原，根据荚膜多糖可将猪链球菌分为35个血清型，即血清l~34型和血清1，2型。其中血清l型、2型、7型和9型对猪的致病性较强，尤其是猪链球菌血清2型，不仅对猪致死性强，而且能引起人的发病和死亡，在公共卫生方面引起了极大的关注。本研究旨在建立针对猪链球菌的快速特异的分子生物学和免疫学检测方法，同时对河南省境内猪群

2、中的猪链球菌感染情况进行调查，为该病的病原分子生物学研究、快速诊断和有效防制提供参考。1．猪链球菌血清2型河南分离株的主要毒力基因鉴定及其cps2J全基因序列分析为了解SS2河南分离株的毒力基因型及cps2J全基因突变情况，本研究设计并合成了7对扩增882毒力基因gdh，cps2J，mrp，el,sty、orf2和fops的特异性引物，建立检测882的7种毒力基因的PCR方法，并对SS2的cps2J进行全基因序列测定和同源性分析。结果表明，gdh，cps2J、mrp，ef,sty、orf2和fops基因在8个$82分离株中的

3、检出率分别为100％(8／8)、100％(8／8)、62．5％(5／8)、75％(6／8)、87．5(7／8)、100％(8／8)和100％(8／8)；其中cps2J全基因核苷酸及推导的氨基酸序列与来源不同的882分离株同源性分别达98％并N97％以上，以该基因构建的系统发育树表明8株SS2河南分离株与国内外不同参考株同源性高，亲缘关系密切。2．猪链球菌血清2型cps2H基因的表达及抗原性分析为研究$82荚膜多糖cps2H重组蛋白的抗原性，利用PCR技术扩增ZMDSC．2(SS2)株的cps2H全基因，将扩增产物与pMDl8

4、．T克隆载体连接，重组质粒经PCR、酶切鉴定后进行测序；将构建的pET32a(+)．cps2H原核表达载体转化至大肠杆菌BL21中，经IPTG诱导表达，表达产物进行SDS．PAGE和Western．blowing分析后，将纯化的cps2H重组蛋白免疫小鼠，用ELISA检测其血清抗体。结果显示：cps2H全基因为1371bp，表达的重组蛋白大小为66．2KDa，最佳的诱导条件为1．0mmolFL的IPTG诱导3h，重组蛋白与SS2阳性血清的免疫印记分析呈阳性反应；小鼠免疫第7天后血清中即可检测到抗cps2H重组蛋白的特异性抗体

5、，并于免疫后第28天达到高峰。上述结果表明：cps2H重组蛋白具有良好的抗原性，可作为8S2的疫苗候选分子和免疫诊断抗原。3．猪链球菌血清2型环介导等温扩增快速检测方法的建立与应用为了建立快速、灵敏的8S2LAMP检测方法，根据GenBank登录的$82特异的荚膜多糖(cps2H)基因序列作为检测靶标，在其序列的保守区域设计LAMP引物，利用参考菌株S735(SS2)基因组DNA为模板进行扩增，优化了LAMP的反应条件和反应体系，并进行了敏感性、特异性和重复性试验。结果表明：利用建立的LAMP方法对SS2进行扩增，扩增产物显

6、色呈现阳性反应，电泳出现阶梯状条带，最低检测量为0．186彰皿模板DNA，比常第3页共74页河南农业大学2012届硕士毕业论文规PCR高1000倍；且与其他常见的细菌无交叉反应，临床样品的检测结果表明，建立的LAMP方法优于普通PCR方法。说明本研究建立的LAMP方法具有灵敏、特异、快速和重复性强等优点，适用于本病的实验室快速检测。4．猪链球菌种及1、2、7、9型多重PCR方法的建立及应用根据嬲谷氨酸脱氢酶(gdh)基因序列和SSl(14)、SS2(1／2)、SS7、脚的型特异cpslI、cps2H、cps7H、cps9G基

7、因序列，分别设计一对种特异性引物和4对型特异性引物，通过优化反应条件，建立了鉴定船及SSl(14)、ss2(1／2)、SS7、SS9的多重PCR检测方法，该方法的特异性和敏感性均良好。应用建立的多重PCR方法对临床上的61份无临床症状猪扁桃体进行了检测。结果显示，61份猪扁桃体S跪出率为77．0％(47／61)，其中SS2占14．8％(9／61)，SS7占4．9％(3／61)，鼹9_(32．8％(20／61)，无SSl存在。该方法可作为鼹陕速诊断和分子流行病学研究的重要手段。5．猪链球菌血清2型抗体IHA检测方法的建立及应用

8、为了建立适用临床上检测SS2抗体的IHA检测方法，用SS2的荚膜多糖(Capsularpolys．accharide，cps)致敏经戊二醛处理过的鸡红细胞，优化致敏醛化红细胞的抗原量和时间。在37℃条件I-CPS(2．251lg／mL)致敏鸡红细胞90分钟，IHA试验在25℃条件下操作，被