猪链球菌2型sly基因在毕赤酵母中的表达及抗血清的制备

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1、ExpressionofSLYGeneofStreptococcusSuistype2inPichiapastorisandPreparationofAntiserar⋯o‘‘1hesissubmittedtoOj叼daoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgronomy1一，WuYaqiong(DepartmentofAnimalScienceandTechnology)Supervisor：Prof．WuYangongProf．Y

2、inYanboProf．ShahHuQingdao．ChinaJune，2012独创性声明IUfllIllJIIPIIIflJlllJJlflJY2332692本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：实∞琢．时间：≯秒／．L年石月勿日关于论文使用授权的说明本人完全了

3、解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：室口红锄＼时间：劢7≯年6月如日研究生签名：与乏。红令萄＼时间：劢7≯年6月如日导师签名：艇谚时间：力J1午钐月；胡时间：勿J1午矽月罗胡青岛农业大学硕士学位论文摘要猪链球菌2型SLY基因在毕赤酵母中的表达及抗血清的制备摘要猪链球茵(Streptococcus，

4、S．suis)是一种重要的人畜共患病病原，猪感染链球茵病的症状表现不一，高致病性菌株感染猪会导致猪的脑膜炎、关节炎、心内膜炎、肺炎、败血症、流产和突然死亡等疾病。根据荚膜多糖抗原将猪链球菌分为35个血清型，其中猪链球菌2型(SS2)致痴}生强、流行广，是最主要的致病原。猪链球菌2型含有多种毒力因子，如荚膜多糖(CPS)、溶菌酶释放蛋白(MR．P)、胞外因子(EF)、猪溶血素(SLY)和IgG结合蛋白等。其中猪链球菌溶血素属于巯基激活类细胞毒素家族，能与宿主细胞受体结合而导致细胞通透性增加并裂解，证实溶血素具有细胞毒性，并能阻断补体介导的杀伤和吞

5、噬作用。因此有学者认为溶血素可能是亚洲和欧洲猪链球菌2型最重要的毒力相关因子。本试验的目的：构建溶血素基因的重组酵母表达质粒，进行甲醇诱导得到溶血素蛋白，分析表达产物的免疫反应性，为猪链球茵2型疫苗研究做基础，并进一步免疫SPF兔得到抗血清，可用于制作单特异性抗血清国家标准物质，也可应用于疫苗的评定。本研究通过分子克隆和酵母表达等方法获得以下结果：1对猪链球菌SS2／C55606株溶血素基因序列和表达载体pPICZaA进行序列分析并设计引物，扩增出溶血素基因，并通过酶切、连接到表达载体pPICZ幽,上，转化到大肠杆菌Topl0感受态细胞中，筛选

6、阳性克隆，得到重组质粒pPICZaA．SS2／C55604．SLY。2将重组载体进行SacI酶切后，得到线性化质粒，用试剂盒进行化学转化到毕赤酵母感受态细胞中，通过对阳性菌株的筛选和酵母基因的PCR鉴定，得到DNA重组毕赤酵母菌株。3使用DNA重组毕赤酵母菌株进行溶血素基因诱导，优化条件为：温度28．5℃，甲醇浓度第ld1％、之后每天2％。在第5d(108h)收获上清，并超滤至原体积的1／10～1／5，得到浓缩蛋白。对蛋白进行SDS．PAGE电泳、溶血试验和间接ELISA鉴定，确定其为溶血素蛋白，且活性很高，进一步纯化可用于疫苗的研究。4对得到

7、的蛋白简单测定其浓度后，与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂混匀乳化，分四次免疫9只SPF新西兰大白兔，心脏采血离心后得到450ml抗血清，进行间接ELISA和琼扩试验鉴定抗血清的效价，其ELISA效价均达到1：16000以上，可用于制作单特异青岛农业大学硕士学位论文摘要性抗血清国家标准物质，以及应用于疫苗的评价。关键词：猪链球菌2型；溶血素；分子克隆；酵母表达；抗血清青岛农业大学硕士学位论文Abs台actExpressionofSLYGeneofStreptococcusSuis够pe2inPichiapastorisandPreparationo

8、fAntiseraAbstractStreptococcussuis(Streptococcus，S．suis)isanimportantzoonot