DB13T 1778-2013 鱼类链球菌病诊断技术规范

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1、ICS67.120.30B50DB13河北省地方标准DB13/T1778—2013鱼类链球菌病诊断技术规范Thenormofdiagnosistechniqueforstreptococcicosisinfish2013-09-05发布2013-09-30实施河北省质量技术监督局发布DB13/T1778—2013前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由河北省质量技术监督局提出。本标准起草单位：河北省水产养殖病害防治监测总站。本标准主要起草人：侯金良、张志华、马瑞欣、李同庆、孙伟彬、邵铁

2、凡、梁艳红、田洋、苏欢欢、薛政。IDB13/T1778—2013鱼类链球菌病诊断技术规范1范围本标准规定了鱼类链球菌病的诊断方法。本标准适用于鱼类链球菌病病原菌的鉴定及本病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T4789.28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义

3、适用于本文件。3.1病原菌链球菌（Streptococcus）呈球形或卵圆形，在液体培养基中以成对或链状出现；革兰氏阳性、触媒阴性、兼性厌氧；在血平板上通常溶血。引起鱼类链球菌病的有海豚链球菌（Streptococcusiniae）、无乳链球菌（Streptococcusagalactiae）、米氏链球菌（Streptococcusmillieri）、副乳房链球菌（Streptococcusparauberis）和停乳链球菌（Streptococcusdysgalactiae）。其中海豚链球菌和无乳链球菌是

4、引起鱼类链球菌病的主要病原菌。4设备和材料设备和材料包括：a)恒温培养箱。b)显微镜：10×～100×。c)灭菌乳钵。d)天平：精度0.1g。e)恒温水浴锅。f)带有热盖功能的PCR仪。g)电泳仪。h)紫外分析仪或紫外观察灯。i)灭菌剪刀、镊子。j)高压灭菌器。1DB13/T1778—20135培养基和试剂培养基和试剂包括：a)水：应符合GB/T6682的要求。b)Todd-Hewitt肉汤（简称THB)。c)血琼脂平板：按GB/T4789.28中规定。d)75％酒精。e)革兰氏染色液：按GB/T4789.

5、28中规定。f)3％H2O2溶液（临时配制）。g)TaqDNA聚合酶。h)酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1）。i)琼脂糖。j)溴化乙锭（EB）。k)标准菌株：海豚链球菌和无乳链球菌标准菌株。l)dNTP：含dATP、dCTP、dGTP和dTTP各10mmol/L。m)PCR引物：本标准以链球菌延伸因子（EF-Tu）tuf基因设计一对引物。扩增片段大小为639bp。使用时浓度为10μmol/L。其序列如下：E1:5′－GGACCAATGCCACAAACTCG－3′E2:5′－TGGAGTATGACGTCCAC

6、CTTC－3′n)DNA分子质量标准（Marker）。o)无水乙醇：使用前预冷至-20℃。6诊断步骤6.1活动情况观察患病鱼游动缓慢，缺乏活力，分散于缓流处，浮于水面，或头向上尾向下呈悬垂状；临死前，病鱼或间断地狂游、翻滚、转圈。6.2外部检查患病鱼单侧或双侧眼球突出、充血，角膜混浊；体色发黑，肛门红肿；鳃贫血，鳃盖下缘、胸鳍基部有出血现象；体表有l处或多处隆起，尤以尾部为多见，隆起部位出血或溃疡。6.3解剖检查患病鱼脑部充血，有出血点；肝脏肿大、出血，或脂肪变性、褪色；脾脏肿大，呈暗红色；胆囊、肾脏肿胀；

7、胃肠或腹腔积水，肠壁充血发炎。6.4病原菌的实验室常规鉴定6.4.1涂片检查用75%酒精棉球擦拭鱼体，在无菌条件下取样品鱼的脑、肾、肝、脾等器官的小块组织,在洁净载玻片上涂片,风干后,革兰氏染色（按GB/T4789.28中的规定）后镜检。如见紫色球菌则表明病料中可能含有链球菌。2DB13/T1778—20136.4.2病原菌分离培养对于有明显症状的鱼，用经火焰灭菌并冷却的接种环于病灶或内部组织无菌取材后划线接种于血琼脂平板。对于无明显症状的鱼，在无菌条件下取样品鱼的脑、肾、肝、脾等器官共25g组织匀质,加入

8、225mL灭菌的THB增菌液（见附录A.1）,28℃培养24±2h后，划线接种于血琼脂平板。将血琼脂平板于28℃培养24h士2h，如菌落生长缓慢，可延长至48h士2h后观察。6.4.3菌落形态和显微镜观察在血琼脂平板上如见灰白色、圆形、微凸、表面光滑、湿润、边缘整齐、半透明或不透明、直径约0.3mm～1mm、β溶血或无溶血的菌落，则为可疑菌落。通过镜检如见成对或呈链状排列的圆形或近圆形、直径大小为0.2μm～1.