犬gm-csf对犬细小病毒vp2 dna疫苗免疫增强作用的研究

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1、河北农业大学硕士学位论文犬GM--CSF对犬细小病毒VP2DNA疫苗免疫增强作用的研究姓名：贾启恒申请学位级别：硕士专业：基础兽医学指导教师：仲飞20120531摘要粒细胞．巨噬细胞集落刺激因子(GM．CSF)是由T细胞、B细胞、内皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞等分泌产生的，是重要的造血生长因子和免疫调节因子，能促进前体细胞的存活、增殖、分化，促进粒细胞和单核／巨噬细胞分化与形成集落。GM．CSF具有招募树突状细胞(DC)、单核细胞等抗原递呈细胞到抗原注射位点的功能，同时在促进树突状细胞前体细胞分化中起着关键作

2、用。因此GM．CSF被认为是一个新一代高效的分子免疫佐剂。犬细小病毒基因组编码的VP2蛋白是该病毒重要的结构蛋白和抗原蛋白。利用VP2基因制备的DNA疫苗能够刺激机体产生免疫应答反应。为进一步提高VP2DNA疫苗的免疫活性，本实验利用犬粒细胞．巨噬细胞集落刺激因子基因作为生物佐剂其对犬细小病毒VP2DNA疫苗的免疫增强作用。首先通过RT-PCR方法从犬淋巴细胞中扩增GM．CSF基因，并将其插入到pcDNA3．1载体上，分别构建该基因的两个真核表达载体：不融合标签的表达载体pcDNA—cGM．CSF和与Myc．

3、His融合的表达载体pcDNA．cGM．CSF／MH。用pcDNA·cGM—CSF／MH载体转染HEK293T细胞进行瞬时表达，通过Western．blot试验证明GM—CSFI～范够在真核细胞中进行分泌表达。然后用本室构建的犬细小病毒VP2基因表达载体与pcDNA-cGMCSF共同免疫小鼠(pcDNA3．1空载体作为阴性对照)。免疫后用ELISA方法检测不同时间小鼠血清的抗体滴度。用MTT法检测小鼠免疫后35d淋巴细胞的增殖活性，同时用ELISA试剂盒检Nd,鼠淋巴细胞Y干扰素的表达水平。结果表明，本实验构

4、建的表达载体能够介导重组GM．CSF在真核细胞中进行分泌表达。免疫实验表明，利用GM．CSF基因与VP2基因共免疫小鼠，抗体的水平显著高于VP2基因单免疫组(P

5、cementGraduateStudent：JiaqihengSupervisor：ZhongFeiMajor：BasicVeterinaryMedicineAbstractGranulocyte-macrophagecolony—stimulatingfactor(GM—CSF)issecretedbyTcells，Bcells，endothelialcells，fibroblasts，macrophages．GM—CSFiskindofimportanthematopoieticgrowthfactora

6、ndimmuneregulatingfactorwhichcouldimprovethesurvival，proliferation，differentiationofprecursorcellanddifferentiation，coloniesformationofgranulocytesandmonocytes／macrophages．GM—CSFcouldattracteddendriticcells．monocytesandotherantigen-presentingcellstotheantig

7、eninjecfionpositionandplaysakeyroleinthedifferentiationofprecursorcells．Therefore，GM—CSFisconsideredanewhighmolecularadjuvant．VP2protein，encodedbycanineparvovirus(CPV)genome，isamajorstructuralproteinandepitope．nleDNAvaccinederivedfromtheVP2genecanstimulatet

8、heimmuneresponsestoCPV．ToenhancetheVP2genevaccinepotency，thedoggranulocyteandmacrophagecolony—stimulatingfactor(GM—CSF)genewasusedasabiologicaladjuvant．GM··CSFgenewasamplifiedbyRT··PCRfromdogspleenlymp