犬细小病毒病毒样粒子口服疫苗的研究

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1、分类号密级UDC单位代码10435硕士学位论文犬细小病毒病毒样粒子口服疫苗的研究OralVaccineofAgainstCanineParvovirusVirus-likeParticles研究生姓名段欣强指导教师王述柏教授单虎教授学科专业预防兽医学研究方向动物传染病防治及生物制品学中国.青岛二0一八年六月OralVaccineofAgainstCanineParvovirusVirus-likeParticlesThesissubmittedtoQingdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegree

2、ofMasterofAgronomyDuanXinqiang（CollegeofVeterinaryMedicine）Supervisor:Prof.WangShubaiProf.ShanHuQingdao.ChinaJune,2018独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年月日关于论文使

3、用授权的说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日青岛农业大学硕士学位论文摘要犬细小病毒病毒样粒子口服疫苗的研究摘要犬细小病毒病(Canineparvovirusdisease,CPVD)是犬细小病毒(Canineparvovirus，CPV)导致犬类以出血性肠炎、心肌炎为主要症状并伴随白细胞减少

4、、呕吐、腹泻现象的一种急性高度接触性传染病。CPV可通过消化道感染，各年龄和品种的犬均可感染，传播速度快，发病率和死亡率高，是犬类主要急性传染病之一，严重影响家养宠物的健康，并对养犬业带来特大经济损失。犬细小病毒病的市售疫苗主要为灭活苗和弱毒苗，且以多联苗为主，具有较好的免疫效果。CPV具有一定的变异性，所以选择的CPV弱毒疫苗也可能存在一定的抗原变异性。免疫接种口服疫苗，没有抗原变异的危险，操作安全、简单、方便。病毒样颗粒(viruslikeparticles,VLPs)模拟天然病毒粒子结构，低剂量即可诱导机体产生高效免疫。针对CPV的主要感染途径及其肠道致病和黏膜免疫的特点，以乳酸

5、菌为载体，设计CPV病毒样粒子口服疫苗。活载体乳酸菌可激发机体免疫反应。本研究以乳酸乳球菌为递呈抗原的载体，利用乳酸菌表达系统表达CPVVP2蛋白。进一步证实CPVVLPs体外组装能力及其免疫原性，是犬细小病毒基因疫苗的一次新的尝试。为研究乳酸菌表达犬细小病毒VP2蛋白的可行性，本试验将CPV的VP2目的基因克隆至乳酸菌表达载体pMG36e，电转化至乳酸乳球菌MG1363。菌液PCR及酶切鉴定正确，提取质粒测序，基因序列与CPV-2a型标准毒株的同源性为99%，测序分析结果正确，成功构建重组表达载体pMG36e-VP2，且成功转化至乳酸菌。重组乳酸菌经诱导表达、蛋白纯化后SDS-PAG

6、E和WesternBlot鉴定，获得蛋白分子大小正确的VP2蛋白，此蛋白与犬源CPV阳性血清发生特异反应，有良好免疫反应性。本试验成功获得表达VP2蛋白的重组乳酸菌，为后续进行重组乳酸菌的免疫原性分析提供科学基础。为确定犬细小病毒VLPs的包装情况，电镜下观察，有与天然CPV粒子相似的空心粒子，确认是犬细小病毒VLPs。为鉴定前期构建的重组乳酸菌的临床效果，测定重组乳酸菌的免疫效果及其抗体水平。以小鼠建立动物模型，通过口服和腹腔注射途径免疫小鼠重组乳酸菌，间接ELISA检测小鼠抗体效价，结果证明免疫重组乳酸菌小鼠的抗体变化规律与免疫CPV弱毒疫苗的相似；且抗体效价明显高于空白对照，差异

7、极显著（P<0.01）。采用HI试验检测小鼠的血清抗体水平，结果表明重组乳酸菌在小鼠体内的总体免疫原性良好。收集小鼠粪便培养细菌，经菌液PCR及双酶切鉴定，所收集得到的细菌为重组乳酸菌。观测菌落生长情况，表明免疫后15d内粪便中可持续检测到重I青岛农业大学硕士学位论文摘要组乳酸菌，一定时期内，肠道中乳酸菌定植情况递减，须定期免疫。综上所述，本研究成功构建了犬细小病毒VP2基因的乳酸菌表达载体，并在乳酸乳球菌MG1363中得到了高效表达，该VP2