犬细小病毒核酸疫苗制备及免疫试验

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1、犬细小病毒核酸疫苗制备及免疫试验邱薇1，范泉水1，李作生1，杨美峰1，郑颖1，李丽红1，王双印1，李江1，夏咸柱2（1.成都军区联勤部军事医学研究所，云南昆明650032；2.解放军军事医学科学院军事兽医研究所，吉林长春130062）摘要：以犬细小病毒基因组DNA为模板，应用PCR方法扩增了全长VP1基因，PCR产物经纯化和NotⅠ/BamHⅠ双酶切后与同样处理的真核表达载体pIRES进行连接，转化到感受态细胞JM109中，筛选了真核重组表达质粒pIRESVP1，并进行了序列测定。对6只9月龄犬分别接种不同剂量的pIRESVP1或空载体质粒及生理盐水，8周接种1次，每次接种前采血，

2、测定血清的血凝抑制抗体效价，第2次免疫后即可检测到较高的血清效价。在第3次接种4周后，对全部实验犬进行攻毒，攻毒后第7天及第14天时采血，测定血清的血凝抑制抗体效价。所有接种pIRESVP1疫苗的犬均能抵抗CPV强毒的攻击，而接种空载体质粒和生理盐水的对照犬则全部发病。证明所构建的核酸疫苗（pIRESVP1）能使犬免受犬细小病毒强毒的感染。关键词：核酸疫苗；犬细小病毒；免疫犬细小病毒（Canineparvovirus,CPV）于1978年首次发现，是细小病毒科中的一个自律性细小病毒，病毒粒子小，无囊膜，属单链DNA病毒。CPV属猫细小病毒亚群，感染犬，在幼龄犬中引起严重的肠炎，在新

3、生幼犬中引起心肌炎。CPV和猫泛白细胞减少症病毒（FPV）核衣壳蛋白的氨基酸序列有98%的同源性[1-2]，由于高度的同源性以及近年来犬病的严重流行，CPV被认为是FPV的一个新宿主变异株[3]。CPV核衣壳基因编码两个重叠蛋白VP1和VP2，VP2是主要的核衣壳蛋白，从VP1开放阅读框的一个框架内ATG编码子开始翻译。VP3是完整的VP2核衣壳N末端除去15个～20个氨基酸形成的。VP1约占CPV核衣壳蛋白的10%，其余90%由VP2和VP3组成。表位图谱试验表明，结合中和抗体的全部抗原决定簇都在VP2中，VP1特有区域中还发现一个Ｔ细胞表位[4]。核酸疫苗（nucleicaci

4、dvaccines，NAVs）就是把能引起机体保护性免疫反应的病原体抗原的编码基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组的质粒DNA直接注射到动物体内，通过宿主细胞的转录系统，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，诱导宿主产生细胞免疫应答和体液免疫应答，从而达到预防和治疗疾病的目的。NAVs诱导体液和细胞免疫，不复制，不感染宿主，易于生产，以及在室温下稳定性好，还提高了毒株间的交叉保护且保持病毒抗原的天然形式[5]。这些性质使NAVs比常规疫苗和重组疫苗更具优越性，具有控制人和动物传染性疾病的潜力。核酸疫苗已实验性地用于鼠，以抗各种病毒和人的肿瘤相关抗原，如流感病毒、

5、人类免疫缺陷病毒Ｉ型、狂犬病毒、乙型肝炎病毒、牛疱疹病毒Ⅰ型、人癌胚抗原以及淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒。传统的灭活和致弱的活病毒（MLV）CPV疫苗含整个病毒粒子，这两种疫苗有较大的免疫原性，新一代MLVCPV疫苗克服了部分母源抗体问题，小剂量疫苗就可产生更高效的免疫[6-8]。其他的CPV疫苗还有利用杆状病毒表达系统的重组疫苗[9]和合成肽疫苗[10-11]，这些疫苗与佐剂一起接种犬后，可诱导抗CPV的免疫保护。但NAVs有避免应用有毒佐剂的优点，另外，重组疫苗只激发一次免疫反应，需多次接种才能获得保护，而NAVs可持续表达CPV病毒抗原，可产生比重组疫苗更好的免疫反应。合成肽疫

6、苗局限于限制了抗原的表位，而CPV的NAVs表达天然、完整的病毒抗原蛋白，能更好地刺激免疫系统。本研究用CPV全长VP1基因构建了真核重组表达载体（pIRESVP1），该载体可诱导犬产生较高的免疫应答，使其能够抵抗强毒的攻击，现报告如下。1材料与方法1.1试剂、细胞株及动物限制性核酸内切酶BamHⅠ、NotⅠ及T4DNA连接酶购自宝生物(大连)有限工程公司。pIRES载体由本实验室保存。DNA胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。大肠埃希菌JM109感受态细胞由本实验室制备。猫肾（F81）细胞、CPV毒种由本实验室保存。6只混合饲养的昆明犬为市售，CPV血凝抑制抗体效价≤2。1

7、.2引物根据文献合成一对引物，上游引物中含BamHⅠ限制位点，下游引物中含NotⅠ限制位点，引物由上海生物工程有限公司合成。引物序列如下：P15′-CGGGATCCGAGACGACTTGGATTAAGGTA-3′；P25′-GTGCGGCCGCTAGTTGATATGTAATAAAC-3′。1.3方法1.3.1CPVDNA的制备用从感染犬粪便中提取的CPV2b型病毒接种猫肾（F81）细胞，收集上清液，浓缩，用苯酚∶氯仿（1∶1）抽提5次，乙醇沉淀DNA，溶解于10mm