非食桑昆虫蓖麻蚕和柞蚕β-ffase的体内外表达和活性分析

《非食桑昆虫蓖麻蚕和柞蚕β-ffase的体内外表达和活性分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、万方数据万方数据摘要蓖麻蚕(Samiacynthiaricini)和柞蚕(Antheraeapernyi)是与家蚕(Bombyxmori)亲缘较近但食性不同的鳞翅目昆虫。桑叶的乳汁中含有大量的DNJ、D-AB1等糖类似生物碱，是α-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20)的强力抑制剂，对蓖麻蚕等非食桑昆虫有很强的毒性，但家蚕却以桑树为唯一寄主植物。家蚕BmSuc1是首个被分子克隆和功能鉴定的动物型β-呋喃果糖苷酶(EC3.2.1.26，β－FFase)编码基因，可能与家蚕抵抗桑叶生物碱毒性的适应机制有关。我们

2、的前期研究发现，蓖麻蚕和柞蚕的体内也存在β－FFase同源基因，其中蓖麻蚕有2个(ScSuc1和ScSuc2)，柞蚕有3个(ApSuc1a、ApSuc1b和ApSuc2)。这些基因在蓖麻蚕和柞蚕的5龄3天幼虫体内几乎不被转录，进一步暗示了β－FFase的表达调控机制可能涉及食桑/非食桑昆虫的食性选择与进化。本研究首先调查了蓖麻蚕、柞蚕和家蚕体内蔗糖水解酶的特性。发现非食桑昆虫蓖麻蚕和柞蚕的中肠蔗糖水解酶主要为α-葡萄糖苷酶，而食桑昆虫家蚕中肠的蔗糖水解酶主要为不受DNJ抑制的β－FFase。以加有DNJ

3、的蔗糖和棉籽糖作为底物，对中肠总蛋白β－FFase活性的分析结果进一步表明，蓖麻蚕和柞蚕的中肠粗提物几乎没有水解果糖基的能力，即没有表现出β－FFase的酶学特征，而家蚕的中肠粗提物具有显著的水解果糖基的β－FFase活性。同时，根据前期研究所获得的蓖麻蚕和柞蚕β－FFase同源基因的上下游及中间片段的cDNA序列设计引物，利用重叠延伸PCR的方法对各片段进行拼接，成功获得了上述5个基因的全长ORF。将拼接得到的各基因ORF和BmSuc1分别构建pET-24b重组表达载体，转化至E.coliBL21(D

4、E3)中，对重组子进行原核诱导表达，并优化了可溶性蛋白的诱导条件。Westernblot结果表明ScSUC1、ApSUC1a和BmSUC1的重组蛋白表达获得成功，其他三个重组蛋白均未得到表达。对表达成功的重组蛋白进行大量诱导表达，用Ni-NTA亲和层析柱分离纯化目的蛋白，采用3,5-二硝基水杨酸法比较了ScSUC1、ApSUC1a和BmSUC1的酶活特征。pH对酶活性的影响曲线表明，相对于BmSUC1，ScSUC1和ApSUC1a几乎没有活性，说明ScSUC1和ApSUC1a可能本身并不具备β－FFas

5、e的酶活特性，或其功能活性更需要借助于翻译后的加工和修饰作用。本研究从体内和体外两方面对蓖麻蚕和柞蚕的β－FFase活性特征进行了检测和分析，实验结果证实了蓖麻蚕和柞蚕的中肠不存在功能性β－FFase，为进一步探索β-FFase在家蚕等食桑昆虫抵抗桑叶生物碱的分子机制中的作用奠定了理论基础。关键词：蓖麻蚕，柞蚕，β-呋喃果糖苷酶，原核表达，酶活性I万方数据AbstractSamiacynthiariciniandAntheraeapernyi,forwhichmulberrytreesarenotthe

6、hostplantinnaturalconditions,aretherelativespeciesoftheBombyxmori.Mulberrylatexcontainsextremelyhighconcentrationsoftoxiccomponent---alkaloidalsugarmimicglycosidaseinhibitors,suchas1,4-dideoxy-1,4-imino-D-arabinitol(D-AB1)and1-deoxynojirimycin(DNJ).These

7、sugarmimicalkaloidshavebeendemonstratedtobehighlytoxictotheeri-silkwormS.c.ricini.However,thesecompoundsarenottoxictolarvalofthesilkwormB.mori,whichfeedonlyonmulberryleaves.ThefindingsthatB.moriencodesafunctionalβ-fructofuranosidase(EC3.2.1.26,β－FFase)Bm

8、SUC1anditsactivitywasnotinhibitedbyaα-glucosidase(EC3.2.1.20)inhibitorDNJmightgiveacluetounlockingtheuniqueregulatorysysteminB.morivs.mulberrydefensesystem.Inourpreviousstudies,wehaveisolatedtwoβ-FFasegenesfromS.c.ricini(S