人神经生长因子成熟肽在昆虫细胞中表达和活性测定

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1、摘要神经生长因子(nervegrowthfactor，NGF)是神经系统最重要的生物活性分子之一，兼有神经营养因子与促进神经突起生长双重作用，对神经细胞的生长、发育、分化发挥调节作用，是参与损伤神经再生和功能修复的重要因子。同时，它还参与调节免疫和造血等非神经系统的功能。NGF在人体组织中含量极微，已有报导从胎盘中纯化hNGF，但其组织来源有限，成本高产量低，不能满足对bNGF的需求。利用基因工程方法获得有生物学活性的hNGF制品，对其基础理论研究和临床应用具有重要的意义。Bac．to．Bac系统是一种新颖的杆状病毒表达载体系统．构建及筛选重组病毒比传统的杆状病毒表达系统更为高效简

2、单快捷，业已成为研究真核基因表达较为理想的工具。本实验以带有hNGF全长肽基因的重组质粒pFastBac-preproNGF为模板，扩增出成熟肽B=NGF基因片段。PCR产物经双酶切后与经同样双酶切的转移载体pFaetBael相连接，转化DH5a细胞，构建重组转移载体pFastBac．BNGF并进行测序。测序结果正确后，提取该重组质粒转化进入含有穿梭载体B鲫mid的受体菌DHl0Bae后发生转座，得到含有hNGF成熟肽DNA的重组穿梭载体rBacmid．BNGF。再将这一重组穿梭载体转染贴壁培养的昆虫细胞St9，得到重组病毒rAcY．Bac．日_NGF。经鉴定正确后进行昆虫细胞Sf

3、9的感染。分别将Sf9感染后培养上清和细胞总蛋白进行SDS．PAGE电泳分析，结果显示感染细胞总蛋白在14．6kDa左右有一表达带而其培养上清及正常培养的细胞均无相应条带。该分子量大小同预期NGF成熟肽蛋白相符，证明表达产物为非分泌型表达，约占到细胞总蛋白的5．69％。并且表达产物经western-blot检测和PCI2细胞法检测具有神经生长因子的免疫学及生物学活性。关键词：Bac-to-Bac系统神经生长因子杆状病毒昆虫细胞AbstraetAbstractNervegrowth自ctorisoneofthemostimportantfactorswithbiologicalact

4、ivity,playingallimportantrolein佗gIIlatingthegrowth,development,differentiationandsurvivaloft．heneuronbutalsototheregenerationandtherehabilitationofthescathednervecells．Mornover,it啪effectsthenon-neuralsystemslikeimmunesystemandhemawpoieticsystem．TheleveloftheNGFinhumanbodyisverylow．Fromtherepor

5、taboutthepurifiedNGFfzomhumanplacenta,thetissuefzomwhichwe伽isolatetheNGFwithbiologicalactivityisverylimited,butalsoitsproductistoolowtomeettheneeasoftheNGFforpeople．SoithasgreatsignificancetoisolatehNGFwithnativesmlctureandbiologicalactivitybygeneticengineeringforitstheoryresearchandclinicappl

6、ication．Bat-to-Bacsysteminwhichforeigngenecanbeinsertedintoabaculovimsshuttlevector(BacⅡlid)propagatedinE．colibysite—specifictranspositionisanovelBaculovirusExpressionVectorSystem．Thissystemshowmoreconvenienceandhigherefficiencyinconstructingandscreeningrecombinantviruscomparedwithtraditionale

7、xpressionsystem,itiswidelyusedasanidealeukaryoticgeneexpressionsystem．InoHrresearch,wechosetherecombinanttransfervectorpFastBac-preproNGFwhichcontainstheSequencesencodingthepre-pro—peptideofhNGFastemplate．Bypolymerasechainreaction,these