白藜芦醇对高糖培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞p27kip1表达的影响及机制研究

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1、河北医科大学硕士学位论文白藜芦醇对高糖培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞P27kip1表达的影响及机制研究姓名：张甜甜申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：赵占胜201203中文摘要白藜芦醇对高糖培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞p27瞄P1表达的影响及机制研究摘要目的：糖尿病(diabetesmellitus，DM)是一种无法治愈的慢性疾病。糖尿病大血管并发症包括高血压、冠心病、脑血管疾病及周围血管疾病，是糖尿病患者死亡的首要原因。与非糖尿病患者相比，糖尿病心血管疾病死亡的风险增加3倍，脑死亡的风险增加2倍，截肢的危险增加

2、5倍。糖尿病并发症最终成为糖尿病的主要问题。然而，在诊断糖尿病时，约1／4的糖尿病患者已经存在一种或多种并发症。动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是大血管并发症的基本病理改变，血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecells．VSMCs)的增殖在动脉粥样硬化发展过程中起着关键作用。流行病学研究显示，尽管法国南部居民有高脂饮食的习惯，但是因为其长期饮用富含白藜芦醇(resveratrol，Res)的红葡萄酒，心血管疾病的发生率和死亡率远远低于其他有相似饮食习惯的西方国家，这就是著名

3、的“法兰西悖论"(Frenchparadox)。白藜芦醇是红葡萄酒中含量很高的一种非黄酮类多酚化合物，是植物在应激状态下产生的一种抗毒素，具有广泛的生物和药理学作用，包括抗氧化应激、抗炎、心血管保护作用、降低血糖、改善胰岛素抵抗、调节脂质代谢、免疫调节、抗肿瘤、抗衰老及雌激素样活性等等。白藜芦醇可通过影响脂蛋白氧化、VSMCs增殖、血小板聚集、炎症反应等多种机制，对动脉粥样硬化起到防治作用。研究显示，细胞周期素激酶抑制剂(cyclin-dependentkinaseinhibitor，CKI)p27酬P可通过调控细

4、胞周期的进程影响动脉粥样硬化的发生发展。细胞周期进程受细胞周期调节蛋白(cellcycleregulatingprotein，CCRP)的精密调控，包括正性调节蛋白和负性调节蛋白。p27bPl作为一种负性调节蛋白，在G1晚期减少，使细胞顺利通过Gl／S期限制点进入S期，完成细胞增殖。本实验通过研究白藜芦醇对大鼠胸主动脉平滑肌细胞增殖、p27“P1蛋白表达的影响，探讨糖尿病大血管并发症的发病机制及白藜芦醇的药理作用。中文摘要实验方法：1．采用细胞培养的方法：以大鼠胸主动脉平滑肌细胞株A7r5(细胞株购自中国培养物典藏

5、中心)为研究对象。将冻存的血管平滑肌细胞株迅速投入37℃温水中，同时摇动冻存管使快速解冻，解冻后800转／min离心5rain，弃上清，加入含20％FBS的DMEM培养基5ml混匀，接种于培养瓶中，放于37℃、5％C02孵箱中孵育，待细胞铺满瓶底的90％后进行传代。取处于对数生长期的细胞分别接种于50“培养瓶和96孔培养板培养24小时，后更换于无血清DMEM培养基培养24小时，使细胞处于饥饿状态并同步于GJGl期，然后分7组进行实验：①正常对照组(contr01)：5．5mmol／L葡萄糖②高糖培养组(25G)：2

6、5mmol／L葡萄糖③甘露醇对照组(Mannit01)：5．5mmol／L葡萄糖+19．5mmol／L甘露醇‘④高糖+25R组(25G+25Res)：芦醇⑤高糖+50R组(25G+50Res)：芦醇25mmol／L葡萄糖+25pmol／L白藜25mmol／L葡萄糖+50pmol／L白藜⑥高糖+100R组(25G+100Res)：25mmol／L葡萄糖+100lamol／L白藜芦醇’⑦高糖+抑制剂组(25G+SB203580)：25mmol／L葡萄糖+10pmol／LSB2035802．取处于对数生长期的细胞，用MT

7、T法检测不同浓度Res对高糖孵育下VSMCs增殖活性的影响。3．取处于对数生长期的细胞，应用流式细胞技术检测不同浓度Res对高糖孵育下VSMCs细胞周期进程的影响。4．取处于对数生长期的细胞，应用Westernblot技术检测不同浓度Res对高糖孵育下VSMCs细胞p-p38MAPK、p27bPl蛋白表达。结果：1．用MTT法检测VSMCs的增殖活性，结果显示在高糖诱导下，VSMCs显著增殖(P

8、MCs增中文摘要殖(P